瑞芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制

刘芳，王会英

(河北大学附属医院北院，河北保定071000)

瑞芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制

刘芳，王会英

(河北大学附属医院北院，河北保定071000)

目的 观察瑞芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，探讨其作用机制。方法 将30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和瑞芬太尼组，每组10只。模型组和瑞芬太尼组结扎左冠状动脉再松开结扎线制备心肌缺血再灌注损伤模型，假手术组仅在左冠状动脉下穿线不结扎。瑞芬太尼组于再灌注前10 min静脉输注瑞芬太尼10 μg/(kg·min)，假手术组和模型组静脉输注等量生理盐水。再灌注后24 h，取结扎线同水平缺血区心肌组织，采用HE染色观察心肌组织病理学改变，采用RT-PCR及Western blotting法检测心肌组织脂肪酸合成酶(Fas)、Caspase-3、Bcl-2 mRNA及蛋白表达。结果 心肌缺血再灌注24 h时，假手术组心肌细胞排列规则，细胞边界清楚、胞核完整；模型组心肌细胞排列紊乱、边界不清晰，心肌纤维断裂，部分胞核消失；瑞芬太尼组心肌细胞排列稍疏松、胞核溶解较少，损伤程度介于假手术组和模型组之间。瑞芬太尼组和模型组心肌组织Fas、Caspase-3 mRNA及蛋白相对表达量均高于假手术组，瑞芬太尼组均低于模型组，组间比较P均<0.05；瑞芬太尼组和模型组心肌组织Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达量均低于假手术组，瑞芬太尼组高于模型组，组间比较P均<0.05。结论 瑞芬太尼后处理可减轻心肌缺血再灌注损伤，其作用机制可能与抑制Fas、Caspase-3表达，促进Bcl-2表达，抑制心肌细胞凋亡有关。

心肌缺血再灌注损伤；瑞芬太尼；脂肪酸合成酶；Caspase-3；Bcl-2；大鼠

心肌缺血再灌注损伤是心外科手术操作中常见的不良事件，其发生机制复杂，涉及诸多环节，心肌细胞凋亡可能是最为重要的环节[1，2]。研究表明，瑞芬太尼后处理有助于保护心肌，缓解心肌缺血再灌注损伤[3,4]，但其作用机制仍不明确。2015年3～8月，本研究观察了瑞芬太尼后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级雄性SD大鼠30只，体质量260～300 g，合格证号：SCXK(豫)：2014-003，由河南省实验动物中心提供。瑞芬太尼购自宜昌人福药业(批号：国药准字H20030197)，脂肪酸合成酶(Fas)、Caspase-3、Bcl-2和β-肌动蛋白兔抗小鼠多克隆抗体及鼠抗兔辣根过氧化物酶标记二抗均购自美国Sigma公司；引物均由上海生工公司设计合成；TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国ABI公司，逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自美国Promega公司，ECL试剂盒和蛋白检测试剂盒均购自上海经科化学科技有限公司；LightCycler480实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司，Image-Pro Plus图像分析软件由美国Media Cybernetics公司提供。

1.2 心肌缺血再灌注损伤模型制作及瑞芬太尼后处理 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组和瑞芬太尼组，每组10只。三组均给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉过程中监测体温、心率、心电图、动脉血气。使用18G静脉留置针进行环甲膜穿刺，并将其套管置入气管，进行机械通气，呼吸比1.5∶1，氧流量2 L/min，频率60次/min，PETCO230～40 mmHg，SpO298%～100%。根据文献[5]的方法构建心肌缺血再灌注损伤模型：于左胸壁3、4肋间距离胸骨左缘0.4～0.6 cm处钝性分层开胸，将5-0丝线从左冠状动脉前降支穿过。假手术组仅将结扎线从左冠状动脉前降支穿过而不结扎，模型组和瑞芬太尼组结扎左冠状动脉。以心电图出现增宽、增高的QRS波或ST段抬高>0.2 mV判定为缺血模型构建成功。持续缺血达45 min时松开结扎线，将心电图所示QRS波逐渐恢复正常或ST段下降判定为再灌注模型构建成功。瑞芬太尼组于再灌注前10 min静脉输注瑞芬太尼10 μg/(kg·min)，假手术组和模型组静脉输注等量生理盐水。再灌注后24 h将所有大鼠麻醉处死，取结扎线同水平缺血区心肌组织。

1.3 相关指标观察

1.3.1 心肌组织病理学变化 取部分心肌组织用生理盐水洗净，4%甲醛固定，制备心肌组织石蜡切片，常规HE染色，于高倍镜下观察心肌组织病理学改变。

1.3.2 心肌组织Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达 采用荧光定量RT-PCR法。取三组心肌组织，研磨后分别加入细胞裂解液1 mL，采用TRIzol法提取心肌细胞总RNA，利用紫外分光光度计对样品进行检测，取A260/A280>1.80样品进行后续操作。Fas引物：上游：5′-ATGGCTGTCCTGCCTCTGGT-3′，下游：5′-CACGAACGCTCCTCTTCAACTC-3′； Caspase-3引物：上游：5′-TCGAGGTCGACGGATTCGATG-3′，下游：5′-CCGCTCTAGAACTAGTGGATC-3′；Bcl-2引物：上游：5′-CTGGGAGAACAGGGTACGA-3′，下游：5′-ATGACCCCACCGAACTCAA-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性60 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，36个循环。每个样品均设置3个平行反应复孔。以β-actin为内参，采用2-△△Ct法计算心肌组织Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA相对表达量。

1.3.3 心肌组织Fas、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达 采用Western blotting法。取三组心肌组织，采用蛋白裂解液提取心肌组织蛋白，测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品进行电泳、分离，转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭60 min，分别加入兔抗鼠Fas(1∶200)、Caspase-3(1∶500)或Bcl-2(1∶400)一抗及相应二抗，ECL发光试剂盒进行发光，采用Image-Pro Plus 图像分析软件对获得的图像进行分析，计算心肌组织Fas、Caspase-3、Bcl-2蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 心肌组织病理学变化 心肌缺血再灌注24 h，假手术组心肌细胞排列规则，细胞边界清楚、胞核完整；模型组心肌细胞排列紊乱、边界不清晰，心肌纤维断裂，部分胞核消失；瑞芬太尼组心肌细胞排列稍疏松、胞核溶解较少，损伤程度介于假手术组和模型组之间。见插页Ⅲ图5。

2.2 心肌组织Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA表达 见表1。

表1 三组心肌组织Fas、Caspase-3、Bcl-2 mRNA相对表达量比较±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 心肌组织Fas、Caspase-3和Bcl-2蛋白表达 见表2。

表2 三组心肌组织Fas、Caspase-3、Bcl-2蛋白相对表达量比较±s)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤发病机制复杂，诱导心肌细胞凋亡是其发生机制之一[6～8]。发生缺血再灌注损伤时，细胞内GRP78表达上调，内质网应激增强，使C/EBP同源蛋白、c-Jun氨基末端激酶等促凋亡信号激活，加速细胞凋亡[9]。本研究心肌缺血再灌注24 h时三组心肌组织HE染色结果显示，模型组心肌细胞排列紊乱、边界不清晰、心肌纤维断裂、部分胞核消失，提示心肌缺血再灌注损伤模型制备成功。

瑞芬太尼是最新的μ阿片受体激动剂，是临床常用麻醉剂，具有药效强、起效迅速、剂量容易控制、安全可靠等优点。研究发现，缺血心肌在再灌注之前越早进行预处理越有利于改善心肌损伤。本研究参照文献[10,11]报道结果，选取再灌注前10 min进行瑞芬太尼后处理，结果显示瑞芬太尼组心肌细胞排列稍疏松、胞核溶解较少，损伤程度介于假手术组和模型组之间，证实瑞芬太尼后处理可减轻缺血再灌注损伤，与文献[3,4]报道结果一致。

Fas/FasL系统在心肌缺血再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡发生过程中发挥关键性作用[12]，Fas是一种细胞表面受体膜蛋白，其伸向细胞质的部分与TNF-α等受体同源，其配体与其结合后可引起Caspase级联反应，导致表达Fas的细胞凋亡，这一过程被称为死亡受体介导的凋亡路径[13]。本研究结果显示，瑞芬太尼组和模型组心肌组织中Fas mRNA和Fas蛋白相对表达量均高于假手术组，提示发生心肌缺血再灌注损伤时Fas基因被激活而大量表达，在心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。Caspase-3作为Caspase家族重要成员，是凋亡的执行蛋白，在凋亡过程中发挥关键性作用[14]。Bcl-2作为抗凋亡基因，可通过抑制线粒体中细胞色素C释放而抑制细胞凋亡发生[15]。本研究显示，心肌发生缺血再灌注损伤时Caspase-3表达上调，Bcl-2表达下调，从而使心肌细胞大量凋亡；瑞芬太尼后处理可抑制Fas和Caspase-3表达，促进Bcl-2表达，从而抑制心肌细胞凋亡的发生，对缺血再灌注过程中心肌细胞具有保护作用。

综上所述，瑞芬太尼后处理可保护心肌细胞，减轻心肌缺血再灌注损伤，其作用机制可能与抑制Fas、Caspase-3表达，促进Bcl-2表达，从而抑制心肌细胞凋亡有关。

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王会英(E-mail: 240690712@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.013

R654.2

A

1002-266X(2016)28-0039-03

2015-10-23)