结肠肿瘤前细胞系的建立及应用

曹海龙　许梦雀　鄢　芳　王邦茂

300052　天津医科大学总医院消化科



·综述·

结肠肿瘤前细胞系的建立及应用

曹海龙许梦雀鄢芳王邦茂

300052天津医科大学总医院消化科

摘要：结肠肿瘤前细胞即永生化结肠上皮细胞系(IMCE)，来源于Immorto小鼠和腺瘤性结肠息肉病基因(Apc)(min/+)小鼠杂交后子代小鼠的结肠上皮细胞，其表型正常，可发生恶性转化，已成为肠道肿瘤发生发展相关研究较为理想的细胞模型。此文主要就该细胞系的建立及其在肠道肿瘤发生机制和筛选防治药物等领域中的应用进展作一综述。

关键词：结直肠癌；结肠肿瘤前细胞；腺瘤性结肠息肉病基因

近年来，结直肠癌(CRC)的发病率明显增加。现有研究已发现与CRC发生密切相关的一些重要的基因突变，如腺瘤性结肠息肉病基因(Apc)、K-ras、p53以及错配修饰基因等[1]。目前仍有必要探讨这些基因突变如何影响正常结肠上皮细胞的表型，含有基因突变的肿瘤前细胞如何发生恶性转化，以及阐明已知CRC中发生变化的分子之间协同作用等。由于体外分化的人正常结肠上皮细胞的培养非常困难，目前国内外研究仍多以结肠癌细胞作为相关研究模型[2-3]，显然这些肿瘤细胞并不完全符合上述研究要求。结肠肿瘤前细胞即永生化结肠上皮细胞系(IMCE)，来源于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠杂交后子代小鼠的结肠上皮细胞，其表型正常，可发生恶性转化，已成为肠道肿瘤发生发展相关研究较为理想的细胞模型[4]。本文主要就该细胞系的建立及其应用进展作一综述。

1结肠肿瘤前细胞系的建立

1.1Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠

Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠的建立为结肠肿瘤前细胞系的建立提供了可能。Immorto小鼠携带了一种温度敏感的猴病毒40(SV40)大T抗原基因(tsA58)的突变形式，使之可置于干扰素-γ(IFN-γ)诱导的H-2Kb启动子(H-2Kb-tsA58)控制下。此外，研究表明80%以上散发性CRC存在Apc基因突变，家族性腺瘤性息肉病(FAP)的发生则主要与Apc基因突变有关[5]。Apcmin/+小鼠是由C57BL/6J雄性小鼠接受突变剂处理后与雌性小鼠 AKR/J 杂交，子代小鼠由于Apc基因两条链中一条链的第850号密码子发生无义突变，编码亮氨酸的密码子(TTG)转变成终止密码子(TAG)，形成截短APC蛋白，导致β-连环蛋白(β-catenin)不能降解，下游靶基因激活，可自发形成肠道多发腺瘤性息肉，是研究肠道肿瘤发生发展的经典动物模型[6-8]。

1.2结肠肿瘤前细胞系的特征

随着Immorto小鼠及Apcmin/+小鼠的建立，有学者在此基础上逐步建立了IMCE细胞系[4,9]。由于IMCE细胞系来自于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠杂交后子代小鼠结肠上皮，因此同时携带一个Apc突变基因和SV40大T抗原基因；而用来源于年轻成年Immorto小鼠结肠上皮建立的细胞系被称之为YAMC细胞系，它与IMCE细胞系最大的区别在于并不携带Apc突变，成为良好的实验对照所需的正常细胞系。SV40大T抗原基因是与p53结合并抑制其在衰老方面作用的一种永生化基因，在允许温度条件下(33℃)，SV40大T抗原基因产物以一种活性形式与p53结合，促进细胞永生。而在非允许温度条件下(37℃～39℃)，基因产物的形式发生改变，不能结合p53使细胞永生。有学者将YAMC、IMCE及结肠癌细胞在分子遗传学、形态学及表型等方面进行了比较，见表1[9]。

表1　YAMC、IMCE细胞系及结肠癌细胞生物学特性的区别

注：iNOS为诱导型一氧化氮合成酶，COX-2为环氧合酶-2

2结肠肿瘤前细胞系的应用

2.1研究结肠上皮细胞功能及其癌变机制

YAMC细胞(Apc+/+)和IMCE细胞(Apcmin/+)作为一种正常结肠上皮细胞和肿瘤前细胞模型已被用于多种细胞生物学功能的实验研究：(1)用于结肠上皮细胞增殖和凋亡调控以及黏蛋白分泌的研究[10-13]；(2)研究诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)及β-catenin等关键分子的调控[14]；(3)探讨各种生长因子对结肠上皮细胞迁移的作用[15]；(4)用于炎症性肠病及肠道肿瘤癌变过程中发生变化的一些重要基因如K-ras[16]、β-catenin[14]、Krüppel样转录因子5(KLF5)[17]等作用的探讨。以下是应用的研究。

KLF与细胞生长调控和癌变有关。研究发现，IMCE细胞中表达的KLF5能够增加克隆形成、细胞周期蛋白cyclinD1的转录及细胞生长，但在结肠癌细胞系中KLF5能减少克隆数量，并与细胞生长呈负相关；而将Ras基因转染IMCE细胞后则发现KLF5水平下调。同样，在Apcmin/+小鼠和FAP患者肠道肿瘤中KLF5 mRNA也显著下降，这些结果提示KLF5的下调可能是肠道癌变过程中的早期分子事件[17]。

瘦素是一种来源于脂肪细胞的细胞因子，与肥胖和肠道炎性反应有关。有学者用YAMC和IMCE细胞系进行研究发现，瘦素可通过诱导天冬氨酸特异性半胱胺酸蛋白酶(caspase)的活性和凋亡途径使YAMC细胞增殖显著下降；而对IMCE细胞则表现为诱导细胞增殖，与胰岛素样生长因子(IGF)的作用类似，瘦素与IGF联合应用可使增殖水平更高，主要涉及的机制是激活p42/44丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p38 MAPK以及促进核因子-κB(NF-κB)的核转位[18]。他们进一步开展了瘦素诱导结肠上皮细胞产生促进血管生成的因子从而促进肿瘤进展方面的研究，结果发现瘦素仅在IMCE细胞中呈剂量依赖性诱导血管内皮生长因子(VEGF)合成，用50 ng/mL瘦素处理IMCE细胞可显著诱导毛细血管形成，VEGF的中和抗体能阻断这一过程[19]。这些研究可能为肥胖相关性CRC的发生提供新的依据和潜在的治疗靶点。

2.2阐明结肠癌变过程中相关分子间的协同作用

YAMC细胞和IMCE细胞还可用于研究结肠癌变过程中相关分子间的协同作用，以下是应用的研究。

2.2.1Apc基因和Ras基因如前所述，由于YAMC和IMCE细胞系均是表型正常的结肠上皮细胞系，可通过表达一种温度敏感SV40大T抗原而有条件地无限增殖。在允许条件下(33℃，加IFN-γ)，YAMC和IMCE细胞系均不能在软琼脂上生长，不能在裸鼠上成瘤。D′Abaco等[16]使用这两种细胞系探讨了一种活化的V-Ha-Ras基因对肿瘤进展的影响，当SV40大T抗原失活时(39℃，不加IFN-γ)，细胞增殖停止；使用携带V-Ha-Ras基因的病毒分别转染细胞，衍生出过度表达V-Ha-Ras基因的细胞系(YAMC-Ras和IMCE-Ras)，与亲代细胞不同的是，在SV40大T抗原失活的条件下，YAMC-Ras和IMCE-Ras细胞仍均能继续增殖并在软琼脂上形成克隆，IMCE-Ras细胞在3周之内即可导致裸鼠成瘤，而YAMC-Ras细胞需要90 d方可诱发裸鼠成瘤。因此，该研究显示Apc基因缺陷和Ras基因活化能协同促使正常结肠上皮细胞恶变。

2.2.2Apc基因和Src基因有研究应用IMCE细胞系证实，癌基因Src活性升高联合Apc功能的部分缺失可导致结肠肿瘤的发生。在允许生长的条件下，通过p53的失活，细胞能够永生化；不论Apc或p53的状态如何，Src的表达能导致与细胞-细胞间连接缺失相关的形态学转变、细胞骨架破坏以及获得侵袭性。携带Apc突变的IMCE细胞表现出Src-介导的锚定非依赖性增殖能力较YAMC细胞更强，β-catenin蛋白水平和转录活性更高，而选择性Src抑制剂能阻断细胞侵袭和锚定非依赖性增殖[20]。

有研究采用逆转录病毒插入诱变技术探讨细胞骨架相关基因在结肠癌变过程中的作用。逆转录病毒转染后仅在IMCE细胞诱导锚定非依赖性转化克隆形成，而在YAMC细胞并不形成克隆。进而在101个独立的转化体中确定了157个逆转录病毒整合位点，发现包括Dnah3、Ahnak、Stk17b和Rbm9等4个寻常整合位点。由于病毒整合，Dnah3和Ahnak上调，Dnah3发生截短，而且过表达Dnah3的IMCE细胞出现微管功能的受损。这些结果表明结肠癌变早期Apc基因相关的肿瘤进展过程中细胞骨架功能相关基因也起到重要作用[21]。

2.3筛选CRC及FAP化学防治的药物

YAMC和IMCE细胞系模型作为正常结肠上皮细胞和肿瘤前细胞还可用于筛选CRC及FAP化学防治的药物，而且可以根据药物对不同细胞系的作用不同，判断药物作用的阶段是正常细胞向肿瘤前状态转化过程还是肿瘤的进展过程，为进一步的体内研究及临床试验提供一些参考依据[9]。目前，应用这些细胞系已筛选出黄酮类化合物、姜黄素和小檗碱等潜在的防治药物。

2.3.1黄酮类化合物有研究应用这两种Apc基因不同的细胞系评价不同黄酮类化合物诱导细胞迁移的程度，并与肝细胞生长因子(HGF)诱导迁移进行比较，发现柑桔素和陈皮素不能诱导细胞迁移，但糖基化的这些黄酮类化合物却能对YAMC和IMCE细胞显示出不同的迁移性，表现为在低浓度下即可诱导IMCE细胞迁移，而对YAMC细胞并无作用，应用基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂证实这种作用依赖于MMP活性。因此，糖基化的黄酮类化合物对肿瘤前细胞迁移表型的诱导可能是CRC防治的一个新机制[22]。

2.3.2姜黄素Fenton等[15]分别给予YAMC和IMCE细胞系一定浓度的姜黄素、表皮生长因子(EGF)及HGF，发现给予EGF和HGF 24 h后，YAMC细胞较IMCE细胞具有更大的迁移反应，姜黄素组IMCE细胞较YAMC细胞反而具有更大的迁移反应；还发现EGF和HGF诱导细胞迁移依赖Apc基因和膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)活性，而姜黄素诱导迁移并不依赖Apc。

2.3.3小檗碱笔者从美国Vanderbilt大学引入该细胞系，在国内率先开展相关研究，发现小檗碱可剂量依赖性抑制IMCE细胞的增殖，促进细胞凋亡，这种作用可能与抑制表皮生长因子受体(EGFR)和蛋白激酶B的磷酸化有关[23]。Wang等[24]研究发现，小檗碱促进IMCE细胞凋亡的机制为caspase非依赖途径，可能通过刺激活性氧的产生进而引起组织蛋白酶B的释放和多腺苷二磷酸多聚酶激活，最终引起凋亡诱导因子活化，而对YAMC细胞并无此效应。小檗碱还能刺激IMCE细胞泛素连接酶Cbl活化、促进Cbl和EGFR的相互作用以及EGFR泛素化下调，从而抑制细胞增殖，敲除Cbl能阻断小檗碱下调EGFR及抑制细胞增殖的作用[25]。由于IMCE细胞是一种表型正常的结肠肿瘤前细胞，因此小檗碱可能在早期阶段即能发挥防治肿瘤的作用。

3存在的问题及展望

结肠肿瘤前细胞系也存在一些局限性，如IMCE来源于Immorto小鼠和Apcmin/+小鼠杂交的子代小鼠的结肠上皮，但后者息肉主要出现在小肠，结肠息肉较少，与结肠肿瘤和FAP患者的息肉主要发生在结肠并不一致；YAMC仍不具备正常结肠上皮细胞的全部特性，如不能在细胞表面形成刷状缘，仅能形成一些微绒毛。尽管如此，这些细胞系的建立使得培养正常结肠上皮细胞及肿瘤前细胞成为可能，近年来在肠道肿瘤防治的研究方面发挥了越来越重要的作用[4,9,26]。今后还需建立更为理想的细胞模型，为进一步深入研究结肠肿瘤的发病机制和化学防治奠定基础。

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(本文编辑：林磊)

(收稿日期：2015-03-23)

通信作者：王邦茂，tjmughgi@hotmail.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81300272，81470796)，高等学校博士学科点专项科研基金(20121202110018)，天津市应用基础与前沿技术研究计划(13JCQNJC10600)

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.01.006