不同基因型幽门螺杆菌对人胃黏膜上皮细胞引起免疫损伤的作用

136000　吉林省四平市中心人民医院消化内科(朱立宁，姚志新)；212001　镇江，江苏大学附属江滨医院消化内科(徐岷，张尤历)



·临床研究·

不同基因型幽门螺杆菌对人胃黏膜上皮细胞引起免疫损伤的作用

朱立宁徐岷张尤历姚志新

136000吉林省四平市中心人民医院消化内科(朱立宁，姚志新)；212001镇江，江苏大学附属江滨医院消化内科(徐岷，张尤历)

幽门螺杆菌(Hp)是一种革兰氏阴性微需氧螺旋状细菌，其与慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌等疾病密切相关。国际癌症机构已将Hp列为Ⅰ级致癌因子。Hp感染在全世界非常普遍，然而只有少部分最终在其他诱因的共同作用下导致胃癌的发生，提示不同基因型的Hp在胃癌的发生发展中起了重要的作用[1]。Hp含有的CagA基因及VacA基因分别编码细胞毒素相关蛋白及空泡毒素，根据两种基因表达情况将Hp菌株分为：Ⅰ型含有CagA及VacA基因，并表达两种蛋白(即CagA+VacA+)；Ⅱ型不含CagA基因，不表达两种蛋白(即CagA-VacA-)；以及一些中间表达型，即表达一种毒力因子(即CagA+VacA-和CagA-VacA+)。本研究以不同基因型的Hp与胃黏膜上皮细胞共孵育，检测炎性因子白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-10的水平变化，以揭示不同基因型Hp的毒力变化及其对免疫微环境的影响，探讨不同基因型的Hp对胃黏膜炎性反应的影响和致瘤性。

1材料和方法

1.1材料

人胃黏膜上皮细胞株(GES-1)来自江苏大学生命科学院细胞库；国际标准菌株NCTC11637(CagA+VacA+)由英国胃肠病学会主席英国诺丁汉大学王后医学中心教授Atherton馈赠；菌株S32(CagA+VacA-)、Z47(CagA-VacA+)、S71(CagA-VacA-)来自江苏大学生命科学院菌株库。主要试剂及仪器：哥伦比亚培养基，DMEM培养基，人HpVacA ELISA试剂盒，人IL-8、IL-10、TNF-α ELISA试剂盒，分光光度计，PCR仪。

1.2方法1.2.1Hp培养及基因鉴定菌株接种于哥伦比亚培养基(哥伦比亚培养琼脂加10%脱纤维羊血及选择性抗生素)，37℃微需氧条件下培养72～96 h。将菌株提取基因组后采用PCR方法鉴定CagA+及CagA-的菌株，利用Primer Premier 5.0软件设计CagA基因引物：上游5′-GCCACTACCACCACCGACAT-3′，下游5′-TGCCTAGCTCCAGGACCAC-3′(上海生工技术有限公司)，PCR产物长266 bp。经人HpVacA ELISA试剂盒鉴定VacA+及VacA-的菌株。

1.2.2GES-1培养将人胃黏膜上皮细胞株GES-1采用DMEM加10%小牛血清常规培养，待细胞生长良好时用于下一步实验。

1.2.3Hp感染细胞模型的建立将处于指数生长期的细胞消化计数，调整浓度为1×105/mL，吸取悬液于24孔培养板中(每孔1 mL)贴壁培养过夜。用分光光度计调整Hp浓度为1.0×109CFU/mL(A660=1×108CFU/mL)，分别取4种不同菌株的菌液100 μL加入培养板中，取100 μL布氏肉汤加入培养板中作为对照，每组重复24孔，培养箱共孵育，取8 h培养上清置于-70℃保存(共孵育超过10 h则有细胞不同程度脱壁、变形及死亡)，用于行ELISA检测。

1.2.4实验分组将布氏肉汤处理细胞的上清液作为对照组，将4种不同基因型Hp菌株(CagA-VacA-型、CagA-VacA+型、CagA+VacA-型、CagA+VacA+型)处理细胞的上清液，分别定为CagA-VacA-组、CagA-VacA+组、CagA+VacA-组及CagA+VacA+组。

1.2.5ELISA检测IL-8、IL-10、TNF-α含量严格按照试剂盒说明书进行操作，450 nm波长读取吸光度值，绘制标准曲线，根据标准曲线取得上述待测品浓度值。

2结果

2.1不同基因型Hp菌株的筛选

提取HpDNA，以CagA基因引物进行PCR鉴定，样本琼脂糖凝胶电泳，在266 bp处可见阳性扩增条带，筛选出CagA+及CagA-的菌株，结果见图1；Hp培养后，PBS洗涤、离心，留取上清，经HpVacA ELISA试剂盒筛选出VacA+及VacA-的菌株，结果见表1。经上述两种方法从菌株库中分离出4种不同基因型的Hp，分别为：NCTC11637(CagA+VacA+)、S32(CagA+VacA-)、Z47(CagA-VacA+)和S71(CagA-VacA-)。

注：M为DL 2000 Marker；泳道1为Z47菌株；2为S71菌株；3为NCTC11637菌株；4为S32菌株。3、4可见266 bp CagA基因PCR扩增片段，1、2未见CagA基因PCR扩增片段

图1　CagA基因型PCR扩增产物电泳图

2.2不同基因型Hp菌株对胃上皮细胞分泌IL-8水平的影响

CagA+VacA+组及CagA+VacA-组IL-8浓度为(58.11±4.15)pg/mL、(56.38±4.40)pg/mL，高于CagA-VacA+组、CagA-VacA-组及对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；后者IL-8浓度分别为(52.32±3.18)pg/mL、(50.84±3.52)pg/mL和(51.30±3.16)pg/mL。见表2。

表2　不同组别上清中细胞因子水平比较±s，pg/mL)

注：与对照组、CagA-VacA-组及CagA-VacA+组相比，aP<0.01

2.3不同基因型Hp菌株对于胃上皮细胞分泌TNF-α水平的影响

CagA+VacA+组及CagA+VacA-组TNF-α浓度为(5.17±0.77)pg/mL、(5.03±0.86)pg/mL，高于CagA-VacA+组、CagA-VacA-组及对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；后者TNF-α浓度分别为(4.20±1.29)pg/mL、(3.88±1.17)pg/mL和(4.17±1.20)pg/mL。见表2。

2.4不同基因型Hp菌株对胃上皮细胞分泌IL-10水平的影响

CagA+VacA+组及CagA+VacA-组IL-10浓度分别为(7.99±1.48)pg/mL、(8.27±1.60)pg/mL，低于CagA-VacA+组、CagA-VacA-组及对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；后者IL-10浓度分别为(10.35±1.47)pg/mL、(10.06±1.78)pg/mL和(10.52±1.65)pg/mL。见表2。

3讨论

Hp定植于胃黏膜上皮细胞后，因受到Hp菌体成分及外泌毒素的刺激而合成多种促炎因子，趋化多种免疫相关细胞聚集到胃黏膜固有层，活化的免疫细胞继续释放细胞因子，募集更多免疫细胞，形成瀑布式循环反应。患者出现明显临床症状时，各种细胞因子在胃黏膜内高表达或低表达，并伴有明显的炎性细胞浸润，这些表现是从Hp定植于胃黏膜上皮细胞开始的[2-3]。本研究关注了不同基因型Hp与胃上皮细胞作用时，胃上皮细胞来源的IL-8、TNF-α、IL-10的表达水平，而且这些细胞因子与Hp导致的后续的炎性细胞浸润等病理生理过程密切相关。

IL-8和TNF-α在炎性反应的发生发展中起着重要的作用，而且与肿瘤发生密切相关。IL-8在Hp阳性的胃窦黏膜中表达较Hp阴性者明显增加，且与炎性程度呈正相关[4]。在慢性胃炎、消化性溃疡患者中，Hp阳性患者胃窦黏膜上皮细胞TNF-α mRNA表达高于Hp阴性患者，且与Hp密度、炎性细胞浸润程度呈正相关[5]。TNF-α除了抗瘤细胞活性外，还可以通过影响靶细胞膜的磷脂代谢引起细胞凋亡和组织损伤[6]，Hp感染后，TNF-α分泌增加，造成胃黏膜上皮细胞凋亡与增殖平衡失调，这可能是引起消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌的重要机制[7-8]。IL-10有很强的抗炎作用，可以抑制IL-8、TNF-α等多种炎性因子的合成，其在Hp致病中可能有类似的效应。在胃部疾病中，各种损伤因子可改变胃黏膜的微环境，导致促炎与抗炎细胞因子之间的失衡，如IL-8、TNF-α等的上调，从而促进炎性反应，IL-10则通过调节免疫、抑制促炎因子的分泌和活性，起着保护黏膜、减少组织损伤的作用[9]。机体受到病原体刺激后，会产生炎性反应，促炎因子和抑炎因子相互制约，共同起着清除病原体、恢复机体免疫稳定状态的作用。Hp感染后，可诱导胃黏膜产生TH1优势的免疫反应，分泌大量的促炎细胞因子(如IL-8、TNF-α)，造成黏膜的免疫损伤，与此同时TH2细胞受到抑制，分泌IL-10减少，导致B细胞分泌的IgA减少，不能有效清除Hp，使Hp持续存在，炎性反应持续存在[10]。

本研究提示，Hp感染人胃黏膜后，IL-8、TNF-α、IL-10分泌水平受CagA+基因型Hp影响，而与VacA+基因型Hp无关。因此，CagA+基因型Hp菌株定植于胃黏膜，可打破IL-8、TNF-α、IL-10分泌水平的平衡，易引起细胞微环境免疫失衡，导致胃上皮细胞损伤，从而引起胃黏膜上皮细胞过度凋亡，造成胃黏膜上皮细胞凋亡与增殖平衡失调。从免疫原理分析，CagA+基因型Hp菌株具有较强的毒力。

通过不同基因型的Hp对胃黏膜上皮细胞诱导IL-8、TNF-α、IL-10分泌能力差异的分析，揭示了CagA+基因型Hp菌株具有较强的毒力，对胃黏膜上皮细胞免疫微环境的影响明显，说明CagA+基因型Hp菌株介导的炎性反应可增加胃黏膜损伤，易导致胃黏膜萎缩，并进展为慢性萎缩性胃炎，甚至胃癌。因此，Hp基因分型对于指导临床治疗及判断预后具有重要意义。

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10 Abbas Z, Yakoob J, Usman MW, et al. Effect of Helicobacter pylori and its virulence factors on portal hypertensive gastropathy and interleukin (IL)-8, IL-10, and tumor necrosis factor-alpha levels[J]. Saudi J Gastroenterol, 2014, 20: 120-127.

(本文编辑：周骏)

(收稿日期：2015-05-20)

基金项目：江苏省卫生厅科技项目(H201047)

DOI:10.3969/j.issn.1673-534X.2016.01.016