Wnt信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其作用机制研究

张惊宇,张力娜,郑永慧,孙永奇，刘路然,赵 虹，杨子超

150081黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科



·论著·

Wnt信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其作用机制研究

张惊宇,张力娜,郑永慧,孙永奇，刘路然,赵 虹，杨子超

150081黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科

【摘要】目的探究Wnt信号通路抑制剂(IWR-1)对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法2014年1月—2015年8月，体外培养脑胶质瘤细胞，给予不同浓度IWR-1处理，采用MTT法测定脑胶质瘤细胞增殖情况，并计算其抑制率，其中实验1组终浓度为5 μmol/L IWR-1、培养液、细胞悬液，实验2组终浓度为10 μmol/L IWR-1、培养液、细胞悬液，对照组添加等量培养液和细胞悬液。采用蛋白质印迹法检测Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平。结果实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于对照组，实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于实验1组(P<0.05)；培养48 h时实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率均高于培养24 h(P<0.05)；培养48 h与24 h对照组脑胶质瘤细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于对照组，实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于实验1组(P<0.05)。结论IWR-1能有效抑制脑胶质瘤细胞增殖，其作用机制可能与抑制Wnt5a蛋白和β-连锁蛋白的表达有关。

【关键词】神经胶质瘤；脑肿瘤；细胞增殖；Wnt信号通路抑制剂

张惊宇,张力娜,郑永慧,等.Wnt信号通路抑制剂对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其作用机制研究[J].实用心脑肺血管病杂志，2016，24(3)：49-52.[www.syxnf.net]

Zhang JY，Zhang LN，Zheng YH，et al.Inhibiting effect of Wnt signaling pathway inhibitors on brain glioma cell proliferation and the action mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(3)：49-52.

脑胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的一种恶性肿瘤，位居所有癌症死亡原因的前十位，患者平均生存时间为14.6个月，5年生存率<5%[1-2]。目前，临床上治疗脑胶质瘤主要以手术为主，术后进行辅助放化疗，但患者术后平均生存期仅为3～5年，其总体治疗效果仍不理想。因此，寻找治疗脑胶质瘤的新途径或新靶点已成为临床主要研究方向[3-4]。相关临床研究表明，Wnt信号通路与中枢神经系统关系密切，其可调节神经干细胞的增殖、迁移和分化[5]。Wnt信号通路在胚胎发育完成后几乎不再发挥相关功能，但在一定病理生理刺激下可被激活[6]，促使Wnt信号通路活化。有学者认为，抑制Wnt信号通路或可成为脑胶质瘤等基因治疗的新方向[7]。本研究通过体外培养胶质瘤细胞，并给予不同浓度的Wnt信号通路抑制剂(IWR-1)进行处理，采用MTT法测定细胞增殖情况，探究IWR-1对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用，并分析其作用机制，现报道如下。

1材料与方法

1.1主要试剂与细胞高糖DMEM培养基(HyClone公司)，胎牛血清(杭州四季青集团公司)，β-actin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，Millipore公司)；脑胶质瘤细胞株购自上海锐赛生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养2014年1月—2015年8月，用移液枪吸取200 μl脑胶质瘤细胞悬液于96孔细胞培养板中，混匀后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养培养24 h，倒置显微镜下观察组织块是否贴壁，取对数生长期、细胞活性>95%的细胞进行后续实验。

1.2.2MTT法取处于对数生长期的脑胶质瘤细胞接种于96孔细胞培养板中，铺板并将待测细胞密度调至3 000个细胞/孔，190 μl培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞培养24 h后，分别添加5 μmol/L IWR-1、10 μmol/L IWR-1，记为实验1组、实验2组。将细胞培养板置于培养箱中继续培养24 h、48 h。培养完毕后，吸弃培养液，每孔加入4 ℃预冷的10%三氯乙酸100 μl，静置5 min后移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出并用去离子水冲洗5遍，室温晾干。每孔加入0.4%磺酰罗丹明B(SRB)染液100 μl，室温下染色15 min后，弃去各孔内染液，用1%乙酸冲洗5次，室温晾干后，用非缓冲Tris-base碱液溶解，在平板振荡器上振荡20 min，酶标仪测540 nm波长处吸光度(OD)，并按公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(%)=〔1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)〕×100%。每组重复检测4次取平均值。实验中设置空白组(仅添加等量的培养液)和对照组(添加等量培养液和细胞悬液)。

1.2.3蛋白质印迹法加入RIPA裂解液150 μl及苯甲基磺酰氟(PMSF)1.5 μl冰上孵育30 min，4 ℃ 1 500 r/min离心15 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。每个样本各取15 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转PDVF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，再分别添加Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白一抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗涤后加入1∶5 000二抗(北京中杉金桥生物科技公司)，用增敏化学发光底物试剂(ECL)处理后在凝胶成像系统显像，采用Image J软件进行蛋白定量分析。每组重复检测3次取平均值。

2结果

2.13组脑胶质瘤细胞增殖抑制率比较3组培养24h、48h时脑胶质瘤细胞增殖抑制率比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于对照组，实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于实验1组，差异有统计学意义(P<0.05)；培养48h时实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率均高于培养24h，差异有统计学意义(P<0.05)；培养48h与24h对照组脑胶质瘤细胞增殖抑制率比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

Table1Comparisonofinhibitionratioofbraingliomacellsproliferationamongthethreegroups

组别培养24h培养48h对照组1.52±0.101.55±0.27实验1组41.57±1.38b60.49±1.35ab实验2组63.15±1.84bc86.73±2.67abcF值753.46544.36P值<0.001<0.001

注：与培养24 h时比较，aP<0.05；与对照组比较，bP<0.05；与实验1组比较，cP<0.05

2.23组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平比较3组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于对照组，实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于实验1组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表23组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平比较

Table2ComparisonofexpressionsofWnt5aproteinandβ-cateninofbraingliomacellsamongthethreegroups

组别Wnt5a蛋白β-连锁蛋白对照组36.84±10.6251.02±12.46实验1组21.06±9.25a34.57±12.01a实验2组13.28±9.04ab20.14±10.58abF值234.57413.58P值<0.001<0.001

注：与对照组比较，aP<0.05；与实验1组比较，bP<0.05

3讨论

脑胶质瘤为最常见的颅内肿瘤，具有典型的“三高一低”(高发病率、高复发率、高病死率、低治愈率)特征[8]。脑胶质瘤占脑肿瘤的50%左右，其发生发展与遗传因素和环境因素共同作用有关，由于其呈浸润性生长且边界不明显，因此手术并不能完全根除病灶，临床治愈率极低[9-10]。目前临床主要采用手术并辅以术后放化疗治疗脑胶质瘤，但治疗效果并不理想[11]。随着分子生物学技术的发展，生物靶向治疗逐渐成为脑胶质瘤的主要治疗方向，寻找肿瘤诊断和预后的特异性分子标志物以及药物治疗的靶目标已成为时下研究的热点[12]。

在脑胶质瘤众多相关潜在分子标志物中β-连锁蛋白备受瞩目，β-连锁蛋白不仅参与细胞的增殖及分化、组织器官生长发育、损伤后组织修复等病理生理过程，且在诸多肿瘤组织中均呈高表达[13]。国内外最新研究结果显示，β-连锁蛋白的表达水平与肿瘤侵袭、转移以及预后紧密相关，很可能是在肿瘤发生、发展和转移等多个环节中发挥作用的重要癌基因[14-15]。对Wnt信号通路的最早认识来自于果蝇发育机制和致癌病毒的研究。Wnt/β-连锁蛋白是经典的Wnt信号通路，也是目前研究较详细的一条Wnt信号转导通路；其中，β-连锁蛋白是Wnt信号通路中将信号向细胞核传递过程中的重要信号分子。β-连锁蛋白作为Wnt信号通路的关键蛋白，其去磷酸化可降低Wnt信号通路向核内转移，是目前引起人们广泛关注的靶向治疗方案[16]。有学者认为，抑制Wnt信号通路是脑胶质瘤基因治疗的新策略之一[17]。Wnt5a蛋白属于Wnt蛋白家族成员之一，Wnt家族蛋白不仅在细胞的增殖、分化中发挥调节作用，亦在多种肿瘤中表达异常，或增高或降低或缺失。Wnt5a蛋白同样也参与了肿瘤的发生发展，包括肿瘤细胞血管生成、迁移、侵袭等恶性生物学过程[18]。

IWR-1是新合成的Wnt信号通路小分子抑制剂,可以通过稳定Axin降解复合物而抑制Wnt信号通路[19]。本研究结果显示，实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于对照组，实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率高于实验1组；培养48 h时实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞增殖抑制率均高于培养24 h；培养48 h与24 h对照组脑胶质瘤细胞增殖抑制率间无差异；表明不同浓度的IWR-1对脑胶质瘤细胞的增殖均具有明显抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显。蛋白质印迹实验结果显示，实验1组、实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于对照组，实验2组脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达水平低于实验1组；表明IWR-1可抑制脑胶质瘤细胞中Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白表达，而Wnt5a蛋白、β-连锁蛋白即Wnt5a/β-连锁蛋白信号途径，因此推测Wnt5a/β-连锁蛋白信号通路或可成为治疗脑胶质瘤的新靶点。

综上所述，IWR-1能有效抑制脑胶质瘤细胞增殖，其作用机制可能与抑制Wnt5a蛋白和β-连锁蛋白的表达有关。

作者贡献：张惊宇、赵虹进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；张力娜、郑永慧、孙永奇、刘路然进行实验实施、评估、资料收集；杨子超进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：毛亚敏)

Inhibiting Effect of Wnt Signaling Pathway Inhibitors on Brain Glioma Cell Proliferation and the Action Mechanism

ZHANGJing-yu，ZHANGLi-na，ZHENGYong-hui，etal.DepartmentofNeurology，theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，Harbin150081，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the inhibiting effect of Wnt signaling pathway inhibitors(IWR-1)on brain glioma cell proliferation and the action mechanism.MethodsFrom January 2014 to August 2015，their brain glioma tissues were collected to culture in vitro.MTT method was used to detect the cell proliferation，and the inhibition ratio was calculated；thereinto the final concentration of A group was 5 μmol/L(including IWR-1，culture solution and cell suspension)，of B group was 10 μmol/L(including IWR-1，culture solution and cell suspension)，while C group included equivalent culture solution and cell suspension only.Western blot method was used to detect the expressions of Wnt5a protein and β-catenin.ResultsThe inhibition ratio of A group，of B group was statistically significantly higher than that of C group，respectively，and the inhibition ratio of B group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.05).After 48 hours of culture，the inhibition ratio of A group，of B group was statistically significantly higher than that after 24 hours of culture，respectively(P<0.05)，while no statistically significant differences of inhibition ratio of C group was found compared to that after 24 hours(P>0.05).The expressions of Wnt5a protein and β-catenin of A group and B group were statistically significantly lower than those of C group，expressions of Wnt5a protein and β-catenin of B group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05).ConclusionIWR-1 can effectively inhibit the brain glioma cell proliferation，its action mechanism is possibly correlated with the inhibition of expressions of Wnt5a protein and β-catenin.

【Key words】Glioma；Brain neoplasms；Cell proliferation；Wnt signaling pathway inhibitors

(收稿日期：2015-12-03；修回日期：2016-03-06)

【中图分类号】R 739.41

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.03.013

通信作者：赵虹，150081黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科；E-mail：zhaohong661214@163.com

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531257)