水稻WRKY转录因子基因家族响应外源一氧化氮的表达谱分析

孟姣王海华，2，3，＊向建华蒋丹彭喜旭，3贺欢欢

（1湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201；2重金属污染土壤生态修复与安全利用湖南省高校重点实验室，湖南湘潭411201；3园艺作物病虫害防治湖南省重点实验室，湖南湘潭411201；＊通讯联系人，E－mail：hhwang＠hnust.edu.cn）



水稻WRKY转录因子基因家族响应外源一氧化氮的表达谱分析

孟姣1王海华1，2，3，＊向建华1蒋丹1彭喜旭1，3贺欢欢1

（1湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201；2重金属污染土壤生态修复与安全利用湖南省高校重点实验室，湖南湘潭411201；3园艺作物病虫害防治湖南省重点实验室，湖南湘潭411201；＊通讯联系人，E－mail：hhwang＠hnust.edu.cn）

孟姣，王海华，向建华，等.水稻WRKY转录因子基因家族响应外源一氧化氮的表达谱分析.中国水稻科学，2016，30（2）：111－120.

摘 要：一氧化氮（nitric oxide，NO）信号分子与WRKY转录因子均参与植物抗逆、发育与代谢等许多生理过程。采用Agilent水稻全基因组cDNA芯片分析了NO处理后1、6和12h水稻幼苗WRKY转录因子基因的表达谱，鉴定出在1个时间点有两倍或两倍以上表达变化的WRKY基因32个，主要分布在WRKY的Ⅰ和Ⅱ组，其中75%的Ⅱa和45.6%的Ⅱd亚组成员为差异表达基因；鉴定出至少在2个时间点有两倍或两倍以上表达变化的WRKY基因15个，均为早期（1h）应答，且多数（64.2%）持续上调；基因功能预测分析表明，这些基因主要参与生物学过程中的细胞过程、代谢过程和刺激响应，以及分子功能中的转录调节活性和结合；代谢通路分析表明，WRKY24涉及植物与病原菌相互作用代谢通路。实时荧光定量PCR验证结果与芯片杂交结果基本一致，印证了芯片杂交结果的有效性。上述发现提示，NO信号可能参与了WRKY转录因子介导的生物学调控功能，并为这些基因的进一步功能分析奠定基础。

关键词：水稻；WRKY转录因子；一氧化氮；基因表达谱

植物在正常生长条件下的发育与代谢以及在环境胁迫条件下的应答均涉及一系列相关基因在空间和时间上的差异表达与调控。转录是基因表达的第一步，体现了效率和灵活的原则，因此，转录水平的调控在植物基因表达调控中占据中心位置。转录因子与靶基因启动子中的顺式元件特异结合，从而激活或抑制基因的表达，在植物的发育、代谢以及环境适应等诸多生理过程中扮演重要的角色。全基因组基因鉴定表明，拟南芥和水稻基因组分别有超过2100和2300个转录因子基因，而且相当大比例的转录因子基因为植物所特有［1］。转录因子基因在全基因组尺度上的cDNA微阵列表达分析和突变体的遗传分析都证明了它们在植物基因表达调控中的重要性。

WRKY蛋白在高等植物中构成转录因子超家族［2］。它们最典型的结构特征是含有1～2个保守的WRKY结构域：由大约60个氨基酸组成，其N端的七肽WRKYGQK十分保守，C端为锌指结构。根据所含WRKY结构域的数目和锌指类型，WRKY蛋白可分成三个组别。第Ⅰ组含两个WRKY结构域，锌指类型为C－X4－5－C－X22－23－H－X－H；第Ⅱ和Ⅲ组只含1个WRKY结构域，锌指分别为C－X4－5－C－X22－23－H－X－H和C－X7－C－X23－H－X－C。WRKY蛋白C端的WRKY结构域具DNA结合活性，而N端的WRKY结构域可能介导蛋白质之间的相互作用，或具有辅助DNA结合的活性。WRKY蛋白绝大部分均与W盒［（T）（T）TGAC （C／T）］顺式元件结合［2］，从侧面反映了WRKY域的保守性。WRKY保守结构域外的氨基酸顺序分歧较大，这与不同的WRKY转录因子具有不同的生物学功能相符。

WRKY转录因子最显著的功能是调节植物抗病反应［3］，并在植物抗高温／低温、高盐、干旱、渗透和营养饥饿等非生物逆境以及发育和代谢中具有重要的调节功能［4－5］。WRKY转录因子对植物生理过程的调节作用与水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）等激素介导的信号途径密切相关。例如，拟南芥WRKY70（AtWRKY70）和水稻WRKY13（Os－WRKY13）位于SA和JA抗病信号途径的交叉点，通过激活前者而抑制后者，从而调控植物抗病反应［6－7］。我们已证明，OsWRKY4作为JA信号途径中的正调节子，介导水稻对纹枯病的抗性［8］。突变体的遗传分析表明，AtWRKY40、AtWRKY18和 AtWRKY60的敲除突变体均在种子萌发过程中表现出ABA超敏表型，三者协同在ABA信号传递中起负调控作用［9］。

全基因组表达谱分析有助于初步推测基因家族成员的生物学功能。Ryu等［10］运用RT－PCR和Northern杂交研究了水稻WRKY基因家族在稻瘟病菌接种以及SA和JA处理下的表达谱，发现在所检测的45个WRKY基因中有15个表达上调，Os－WRKY45和OsWRKY62的表达受SA诱导，Os－WRKY10、OsWRKY82和OsWRKY85的表达受JA诱导，而OsWRKY30和OsWRKY83既受SA又受JA诱导。Ramamoorthy等［11］运用RT－PCR在全基因组范围研究了水稻WRKY基因在寒冷、干旱和盐胁迫以及SA、JA、ABA等5种激素处理下的表达谱，结果表明，共有54个WRKY基因的表达发生了显著差异，其中13个基因的表达仅受非生物胁迫的影响，13个基因的表达仅受激素的影响，而剩余的28个基因的表达同时受非生物胁迫和激素的调节，提示WRKY调节非生物胁迫反应和激素介导的信号传递之间存在交互作用。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种具有高度反应活性、膜透性的气态小分子。作为信号激素广泛参与植物发育过程，包括促进种子萌发、气孔关闭、不定根的发生和打破种子休眠等［12］。同时，NO具有缓解植物生物与非生物胁迫的作用，如病原、盐、渗透、热和金属胁迫等［13－14］。NO如何影响植物WRKY的表达以及是否参与该家族对生理的调节作用鲜有报道，然而仍有线索表明水稻WRKY基因受NO的调控。cDNA微阵列杂交分析表明，At－WRKY15、AtWRKY25、AtWRKY40和At－WRKY53在NO处理下显著上调表达［15］。At－WRKY27在拟南芥对细菌萎蔫病菌（Ralstonia solanacearum）抗性反应中发挥负调节作用。Atwrky27突变体对NO供体硝普钠（含有活性亚硝基配体，溶液状态下可释放有活性的NO）的处理十分敏感。表达谱分析表明，WRKY27负调控氮代谢相关基因和NO合成相关基因的表达［16］。然而，从全基因组范围探讨NO对水稻WRKY基因表达的影响未见报道。

为此，我们采用水稻全基因组cDNA微阵列（Agilent，4×44k）对硝普钠处理下水稻WRKY基因进行了转录组学研究，鉴定了受NO调节的WRKY基因（包括差异表达基因和响应基因），运用生物信息学方法对NO响应的WRKY基因进行了GO分析和代谢通路分析，部分WRKY的表达得到了qRT－PCR的验证。

1 材料与方法

1.1 水稻材料培养与硝普钠处理

将水稻日本晴（Oryza sativa L.japonica cv.Nipponbare）播种在添加木村B营养液的蛭石基质上，在人工气候室中培养至3叶1心期，培养条件为光强100μmol／（m2·s），昼夜周期14h／10h，28℃／22℃，相对湿度约85%。用100μmol／L硝普钠溶液（含0.1%吐温80）对水稻进行叶面喷施；为了保证处理充分，另在培养液中添加相同浓度的硝普钠（不含吐温80），分别在处理0（T0，对照）、1（T1）、6 （T6）和12h（T12）后取叶片，用锡箔纸包裹置于液氮中，－80℃下保存。

1.2 叶绿素含量测定

叶绿素提取与含量测定采用分光光度法和Arnon公式计算［17］。

1.3 RNA提取和纯化

总RNA抽提采用TRIZOL试剂，根据厂商提供的标准操作流程进行，经Agilent Bioanalyzer 2100电泳质检合格后，用RNeasy mini kit和RNase－Free DNase Set纯化。

1.4 芯片杂交和数据标准化

采用Agilent rice oligo microarray（4×44k）芯片。该芯片代表了42 489个水稻基因或转录本，所有注解均可在RAP－DB数据库进行查询。芯片杂交和杂交信号处理委托上海伯豪生物技术公司完成，实验方法参照Agilent单色微阵列杂交操作手册。每个时间点的样品进行两次独立的微阵列杂交。从Feature Extraction Software获得的微阵列杂交信号导入GeneSpring GX软件（Agilent Technologies）。数据用P、A、M（分别表示正常、缺失和边缘化的杂交信号）标记，随后用Quantile算法进行标准化，并基于所有样本的信号中值进行基线处理。

1.5 数据筛选、聚类和功能分类

将标准化的数据导入SAS系统，获得数据的相关系数。标准化信号值经Log2处理，计算基因在处理后不同时间点（Tn）与T0间的差异表达倍数（FC）：FC＝MeanTn／MeanT0。将在某一时间点上具有两倍或两倍以上表达变化的基因定义为差异表达基因（DEGs）；将在3个处理时间点上至少在2个时间点有两倍或两倍以上表达变化的基因定义为NO响应基因。

用维恩图鉴定出NO响应基因后，用MeV 4.0软件获得各组重复样本的聚类热图。根据RAP－DB数据库提供的注释文档转换格式后，利用agriGO对NO响应基因进行GO分析，用SAS的分子注释功能得到通路分析图，最后对NO响应的WRKY基因进行表达趋势聚类分析。

1.6 qRT－PCR分析

随机挑选8个WRKY基因，利用qRT－PCR对其表达水平进行验证。用Primer Premier 5.0设计基因特异性引物（表1），扩增产物大小在150bp左右。水稻Actin 1（Os03g0718100）作为内参基因。

cDNA合成之前用DNaseⅠ消除基因组DNA污染。用FastQuant RT Kit（with gDNase）合成cDNA第一链。qRT－PCR在Bio－Rad CFX96PCR System上进行，反应体系包括10μmol／L的正反引物各0.6μL，2×SuperReal PreMix Plus 10μL，cDNA模板6μL，RNase－free ddH2O补至20μL。

表1 候选基因的qRT－PCR引物Table 1.Primers of the candidate genes for qRT－PCR.

反应程序如下：95℃下15 min；95℃下10s，60℃下30s，40个循环。设阴性对照，三次技术重复和两次生物学重复。结果釆用相对定量的方法（2－△△CT）计算基因的表达变化倍数。

2 结果与分析

2.1 微阵列数据相关性分析

将标准化的基因表达各组数据导入SAS系统，用Correlation Analysis分析微阵列杂交实验的相关性，重复样本数据间的相关性系数均大于0.98（结果未显示），说明实验具有较好的重复性，可用于后续分析。

2.2 NO处理下各时间点水稻叶片叶绿素含量测定

为了保证基因转录只发生中等程度的变化和获得特异的基因表达谱，我们对NO供体硝普钠的使用浓度进行了前期的摸索，发现100μmol／L硝普钠处理未对水稻幼苗叶绿素含量（图1）和形态产生明显的影响。

2.3 NO处理下WRKY基因的差异表达分析

手工搜索发现芯片共有WRKY探针112个，代表71个WRKY基因，它们在各时间点的差异表达倍数见在线辅助性表S1（http：／／www.ricesci.cn／CN／article／showSupportInfo.do？id＝2580）。国际上多个独立的研究小组致力于水稻WRKY功能的研究，先后出现了几种不同的WRKY命名系统，给水稻WRKY的研究与交流带来了一些混乱。为此，国际水稻WRKY工作组提出了统一的WRKY命名规则［18］。我们对芯片中71个WRKY基因中不符合规则的编号进行修正。数据筛选结果表明，在3个NO处理时间点的某一时间点发生两倍或两倍以上表达变化的WRKY探针42个，基因32个（表2）。在处理1h时上调表达WRKY基因数为24个，下调9个；在6h时上调表达WRKY基因数为18个，下调表达15个；在12h时上调表达的WRKY基因数为26个，下调表达7个（图2）。

T0、T1、T6、T12分别表示NO处理0、1、6和12h。下同。NO treatments for 0，1，6and 12hare indicated as T0，T1，T6and T12，respectively.The same as below.图1 NO处理不同时间后水稻叶片叶绿素含量Fig.1.Chlorophyll contents in rice leaves after NO treatment for different time.

水稻粳稻基因组中鉴定的WRKY基因家族成员超过100个，分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，其中第Ⅱ组又细分为a～d四个亚组［19］。芯片杂交结果表明，差异表达的WRKY基因在Ⅰ和Ⅱ组中的比例接近，分别为35.3%和36.7%，而占水稻WRKY基因家族最多的Ⅲ组的比例较低（25.0%）。Ⅱa亚组包含4个基因，其中3个为差异表达基因；将近一半（5／11）的Ⅱd亚组为差异表达基因（表3）。

用Venny分析鉴定了在3个NO处理时间点上至少在2个时间点有两倍及两倍以上表达变化的WRKY基因，即NO响应的WRKY基因。结果表明，NO响应的WRKY探针20个，代表15个基因（图3－A）。将基因的差异表达倍数取Log2后导入MEV软件，得到聚类热图（图3－B）。

2.4 NO响应的WRKY基因的GO分析和通路分析

图2 NO处理后不同时间后差异表达的水稻WRKY基因Fig.2.Differentially expressed rice WRKY genes after NO treatments for different time.

Gene Ontology是一种生物本体语言，提供了三层结构的系统定义方式，即分子功能（molecular function）、生物过程（biological process）和细胞组成（cellular component）三个部分。根据RAP－DB数据库所提供的注释文档将基因名称转换格式后，借助在线工具agriGO（http：／／bioinfo.cau.edu.cn／agriGO／）进行GO富集分析，结果表明，注释的15个NO响应的WRKY基因主要富集在生物过程中的细胞过程（cellular process，GO：0009987）、代谢过程（metabolic process，GO：0008152）和刺激应答（response to stimulus，GO：0050896），以及分子功能中的转录调节子活性（transcription regulator activity，GO：0030528）和结合（binding，GO：0005488）（图4）。

表2 NO处理下水稻WRKY差异表达基因的芯片分析Table 2.Microarray analysis of differentially expressed WRKYgenes in rice under NO treatment.

将NO响应的WRKY基因导入SAS系统，通过分子注释发现OsWRKY24（Os01g0826400）参与植物与病原互作通路（详见辅助性图S1，http：／／www.ricesci.cn／CN／article／showSupportInfo.do？id＝2580）。

2.5 NO响应的WRKY基因的表达聚类分析

基于NO处理过程中全基因组水平的基因表达变化的复杂性，对基因差异表达倍数取Log2后，对15个NO响应的WRKY基因的表达规律进行聚类。结果表明，这些基因分为5个具有各自表达规律的类别（图5）。类别1表示持续上调，有9个基因（OsWRKY1、OsWRKY11、OsWRKY12、Os－WRKY15、OsWRKY21、OsWRKY23、OsWRKY28、OsWRKY39和OsWRKY42）；类别2表示持续下调，有1个基因（OsWRKY17）；类别3表示先上调后下调，有1个基因（OsWRKY8）；类别4表示上调－下调－上调，有3个基因（OsWRKY113、OsWRKY69 和OsWRKY24）；类别5表示先下调后上调，有1个基因（OsWRKY3）。

表3 NO处理下水稻WRKY差异表达基因在各组中的分布Table 3.Group distribution of differentially expressed WRKYgenes of rice responsive to nitric oxide.

2.6 基因表达水平的qRT－PCR验证

为了验证微阵列数据的可靠性，利用qRTPCR检测了同—批材料中随机挑选的6个WRKY基因的表达水平。结果表明，除个别WRKY基因的个别处理外（如OsWRKY24和OsWRKY69的T6），qRT－PCR所获得的基因表达水平的变化与微阵列数据基本一致（图6），反映了微阵列数据的可靠性。

3 讨论

面对各种环境胁迫，植物进化出复杂而精巧的适应机制，涉及信号感知、信号转导和相关基因表达的再编程。其中，较为普遍的策略是通过转录因子来调节下游靶蛋白的表达，进而在生长发育与逆境适应之间建立暂时的新的代谢平衡。因此，转录因子作为信号转导途径的终端事件——基因表达的调控者，在植物的适应机制中扮演非常重要的角色。在高等植物中，越来越多的证据表明，WRKY参与了各种胁迫反应、发育和代谢等生理过程［3－5］，而WRKY对植物某些生理过程的调节作用往往与SA、JA、ABA和生长素介导的信号途径相互联系在一起。全基因组表达谱分析证实了上述观点。例如，Dong等［20］用Northern杂交研究了拟南芥WRKY基因家族在植物抗病反应中的表达情况，发现7 2个WRKY基因中有4 3个受SA或病原细菌的诱导，6个受抑制。Kalde等［21］报道，第Ⅲ组的大多数成员既受SA又受病原诱导。同样，在水稻中，Ryu等［10］和Ramamoorthy等［11］采用RT－PCR和Northern杂交对WRKY基因的表达谱进行了研究，发现了一些响应生物或非生物逆境、SA、JA和ABA等激素信号的WRKY基因。

图4 NO响应的水稻WRKY基因的GO分析Fig.4.GO analysis on the NO－responsive rice WRKYgenes.

Log2FC－Log2处理后的基因表达变化倍数。Log2FC indicates Log2transformed expression fold change.图5 NO响应的水稻WRKY基因的表达模式Fig.5.Expression patterns of the NO－responsive rice WRKYgenes.

作为一种高通量、灵敏的基因表达检测手段，基于mRNA表达的基因芯片技术目前广泛应用于植物在正常生长条件下的组织特异性、发育阶段特异性以及在各种逆境下的基因表达谱研究；结合生物信息学方法，可以对差异表达基因进行GO、代谢通路、表达聚类、共表达（coexpression）以及启动子顺式元件分析，相对于RT－PCR、Northern杂交、cDNA－AFLP等传统的基因表达分析手段具有明显的优点。基因表达分析为揭示基因功能提供重要信息。基因在哪种条件下表达，预示该基因可能在该条件下发挥作用。NO作为植物体内重要的信使分子，被证明广泛参与植物的生长发育、代谢以及环境胁迫适应等生理过程［12－14］。本研究用Agilent水稻芯片从全基因组角度系统分析了水稻WRKY基因家族在NO处理下的表达谱。结果表明，NO处理下水稻WRKY基因家族中45.1%（32／71）为差异表达基因，21.1%（15／71）为NO响应基因。注释的15个NO响应的WRKY基因主要富集在生物过程中的细胞过程、代谢过程和刺激应答，以及分子功能中的转录调节子活性和结合，这与WRKY蛋白作为转录因子相互印证。基于cDNA微阵列分析，Palmieri等［15］发现，至少有4个拟南芥WRKY基因的表达受NO调控，其中3个直系同源（ortholog）基因的表达在本研究中亦受NO调控（At－WRKY15与OsWRKY119；AtWRKY40与Os－WRKY28、OsWRKY71；AtWRKY53与OsWRKY113），证明了本研究的可靠性。启动子分析表明，在NO响应基因的启动子区域中有8个类别的转录因子结合位点出现的频率比芯片中所含的28 447个对照基因至少高出15%，其中包含WRKY转录因子的结合位点［15］。这些发现提示NO信号途径可能参与了WRKY调节的生理过程。NO处理下水稻WRKY的差异表达基因比例比拟南芥高，可能与植物种类和NO供体及其处理方式不同有关。在Palmieri等［15］对拟南芥响应NO的基因表达谱研究中，使用的是气态NO，而本实验采用是硝普钠，且同时对水稻幼苗进行了叶面喷施和灌根处理。

Log2FC－Log2处理后的基因表达变化倍数。Log2FC indicates Log2transformed expression fold change.图6 NO响应的水稻WRKY基因表达水平的qRT－PCR验证Fig.6.Expression verification of NO－responsive rice WRKYgenes by qRT－PCR.

我们的表达谱分析结果中也存在着在进化树中两两相聚的成员（旁系同源，paralog）基因都趋向响应NO信号的现象（OsWRKY56与OsWRKY104； OsWRKY28与OsWRKY71；OsWRKY11与Os－WRKY8；OsWRKY23与OsWRKY72），这就暗示它们在功能上也可能具有相似性，为进一步探究水稻WRKY基因家族成员的功能提供了便利。有趣的是，水稻WRKYⅡa亚组包含4个成员，其中3个（OsWRKY28、OsWRKY62和OsWRKY71）属于差异表达基因。WRKYⅡa亚组的4个基因均受SA、JA和稻瘟病菌侵染诱导，OsWRKY28和Os－WRKY71属于稻瘟病菌侵染早期诱导型，Os－WRKY62和OsWRKY76属于晚期诱导型［22］。然而，它们在水稻抗病反应中的作用完全不同。Os－WRKY28、WRKY62和WRKY76是水稻对稻瘟病或白叶枯病的负调因子；而OsWRKY71是水稻对白叶枯病的正调因子［22－25］。WRKYⅡd与钙调蛋白（CaM）相互作用［26］，NO与Ca2＋信号系统交联，调控植物细胞诸多生理过程［27］。将近一半（45.6%，5／11）的水稻WRKYⅡd亚组基因为NO差异表达基因。因此，今后在进一步研究水稻WRKYⅡa和Ⅱd亚组成员的生物学功能时，要关注NO在其中发挥的作用，及其与SA、JA和Ca等其他信号之间的交互影响。

NO为植物应激反应的早期信号分子［12］。水稻WRKY基因家族中的15个NO响应基因的表达聚为5个不同的类别，这些聚类均在NO处理早期（1h）表现出显著的表达差异，其中类别1、类别3和类别4的OsWRKY1、OsWRKY8、OsWRKY11、OsWRKY12、OsWRKY15、OsWRKY21、Os－WRKY23、OsWRKY24、OsWRKY28、OsWRKY39、OsWRKY42、OsWRKY69和OsWRKY113表现为早期上调；类别2的OsWRKY17表现为早期下调。WRKY基因被NO早期诱导或抑制符合WRKY作为转录因子的分子特征。在这些NO响应的WRKY基因中，部分基因的生物学功能得以不同程度的解析，它们主要参与抗病或对非生物逆境的响应。例如，OsWRKY12为Liu等［28］报道的Os－WRKY03，作为转录激活因子，调节水稻对白叶枯病的抗性。OsWRKY23是植物抗病和衰老过程的调节子，超表达该基因的拟南芥植株增强了对丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）的抗性，同时加速了黑暗诱导叶片衰老进程［29］。OsWRKY8参与抵抗渗透胁迫［30］。OsWRKY42能通过抑制JA信号相关基因负调控水稻对稻瘟病菌的响应，与OsWRKY45－2、OsWRKY13组成一个顺次转录调控级联，WRKY45－2转录激活WRKY13，WRKY13能直接抑制WRKY42［31］。最近，我们的研究表明，OsWRKY1和OsWRKY17的同源基因OsWRKY4正调控水稻对纹枯病的抗性［8］。水稻糊粉层细胞中的OsWRKY24的表达受脱落酸（ABA）诱导，但在赤霉素（GA）处理下稳定表达；瞬时表达分析表明OsWRKY24能有效抑制ABA和GA信号途径，提示它作为两条信号通路的共同抑制子，参与调控种子萌发及其萌发后的生长过程［32］。然而，本研究对NO响应的水稻WRKY基因的代谢通路分析表明，OsWRKY24参与植物与病原互作通路，提示它可能在抗病防御中起作用。另外，cDNA代表性差异分析表明，水稻根部组织中OsWRKY17受缺铁胁迫诱导［33］。OsWRKY21受模拟酸雨（pH5.6）诱导，基因芯片杂交结合qRT－PCR验证的结果表明，超表达水稻植株中1个过氧化物酶基因、2个谷胱甘肽转移酶基因和4个细胞色素P450基因表达上调，提示OsWRKY21可能通过调节细胞内氧化还原环境以及降解有害物质来增强水稻对酸雨的抗性［34］。虽然上述研究未曾探究NO信号在这些WRKY基因功能中的作用，考虑到NO在植物抗逆和发育中的广泛功能以及NO与SA、活性氧、ABA等其他信号分子之间的交互作用，结合本研究的结果，可以推测NO信号可能参与上述WRKY基因在植物抗病、抗非生物胁迫、衰老和代谢中的调节效应；同时提示，要进一步深掘这些基因的功能，必须考虑NO信号的潜在作用。据我们所知，仍未有从全基因组角度对水稻WRKY基因家族在NO处理下的表达谱分析。有关NO响应的水稻WRKY的功能有待下一步研究，它们的共表达基因及其启动子区域顺式元件的富集分析也值得期待。

在线辅助性信息：在线辅助性表S1和图S1见中国水稻科学网站（http：／／www.ricesci.cn／CN／artide／showSupportInfo.do？id＝2580）。

参考文献：

［1］ Riaño－Pachón D M，Ruzicic S，Dreyer I，et al.PlnTFDB：An integrative plant transcription factor database.BMC Bioinform，2007，8：42.

［2］ Eulgem T，Rushton P J，Robatzek S，et al.The WRKY superfamily of plant transcription factors.Trends Plant Sci，2000，5：199－206.

［3］ Pandey S P，Somssich I E.The role of WRKY transcription factors in plant immunity.Plant Physiol，2009，150：1648－1655.

［4］ Agarwal P，Reddy M P，Chikara J.WRKY：Its structure，evolutionary relationship，DNA－binding selectivity，role in stress tolerance and development of plants.Mol Biol Rep，2011，38：3883－3896.

［5］ Chen L，Song Y，Li S，et al.The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses.Biochim Biophys Acta，2012，1819：120－128.

［6］ Li J，Brader G，Palva E T.The WRKY70transcription factor：A node of convergence for jasmonate－mediated and salicylatemediated signals in plant defense.Plant Cell，2004，16：319－331.

［7］ Qiu D，Xiao J，Ding X，et al.OsWRKY13 mediates rice disease resistance by regulating defense－related genes in salicylate－and jasmonate－dependent signaling.Mol Plant Microbe Interact，2007，20：492－499.

［8］ Wang H，Meng J，Peng X，et al.Rice WRKY4acts as a transcriptional activator mediating defense responses toward Rhizoctonia solani，the causing agent of rice sheath blight.Plant Mol Biol，2005，89（1／2）：157－171.

［9］ Shang Y，Yan L，Liu Z Q，et al.The Mg－chelatase H subunit of Arabidopsis antagonizes a group of WRKY transcription repressors to relieve ABA－responsive genes of inhibition.Plant Cell，2010，22，1909－1935.

［10］Ryu H S，Han M，Lee S K，et al.A comprehensive expression analysis of the WRKYgene superfamily in rice plants during defense response.Plant Cell Rep，2006，25：836－847.

［11］Ramamoorthy R，Jiang S Y，Kumar N，et al.A comprehensive transcriptional profiling of the WRKYgene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments.Plant Cell Physiol，2008，49：865－879.

［12］Lamotte O，Courtois C，Pugin L B A，et al.Nitric oxide in plants：The biosynthesis and cell signalling properties of a fascinating molecule.Planta，2005，221：1－4.

［13］Gould K，Lamotte O，Klinguer A，et al.Nitric oxide production in tobacco leaf cells：A generalized stress response？Plant Cell Environ，2003，26：1851－1862.

［14］Delledonne M.NO news is good news for plants.Curr Opin Plant Biol，2005，8：390－396.

［15］Palmieri M C，Sell S，Huang X，et al.Nitric oxide－responsive genes and promoters in Arabidopsis thaliana：A bioinformatics approach.J Exp Bot，2008，59：177－186.

［16］Mukhtar M S，Deslandes L，Auriac M－C，et al.The Arabidopsis transcription factor WRKY27influences wilt disease symptom development caused by Ralstonia solanacearum.Plant J，2008，56：935－947.

［17］Arnon D I.Copper enzymes in isolated chloroplasts：Polyphenoloxidase in Beta vulgaris.Plant Physiol，1949，24：1－15.

［18］Rice WRKY Working Group.Nomenclature report on rice WRKY′s－Conflict regarding gene names and its solution.Rice，2012，5：3.

［19］Wu K L，Guo Z J，Wang H H，et al.The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins.DNA Res，2005，12：9－26.

［20］Dong J，Chen C，Chen Z.Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response.Plant Mol Biol，2003，51：21－37.

［21］Kalde M，Barth M，Somssich I E，et al.Members of the Arabidopsis WRKY groupⅢtranscription factors are part of different plant defense signaling pathways.Mol Plant Microbe Interact，2003，16：295－305.

［22］Chujo T，Miyamoto K，Shimogawa T，et al.OsWRKY28，a PAMP－responsive transrepressor，negatively regulates innate immune responses in rice against rice blast fungus.Plant Mol Biol，2013，82：23－37.

［23］Peng Y，Bartley L E，Chen X，et al.OsWRKY62is a negative regulator of basal and Xa21－mediated defense against Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice.Mol Plant，2008，1：446－458.

［24］Yokotani N，Sato Y，Tanabe S，et al.WRKY76is a rice transcriptional repressor playing opposite roles in blast disease resistance and cold stress tolerance.J Exp Bot，2013，64（16）：5085－5097.

［25］Liu X，Bai X，Wang X，et al.OsWRKY71，a rice transcription factor，is involved in rice defense response.J Plant Physiol，2007，164：969－979.

［26］Park C Y，Lee J H，Yoo J H，et al.WRKY group IId transcription factors interact with calmodulin.FEBS Lett，2005，579：1545－1550.

［27］Durner J，Wendehenne D，Klessig D F.Defense gene induction in tobacco by nitric oxide，cyclic GMP，and cyclic ADP－ribose.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：10328－10333.

［28］Liu X Q，Bai X Q，Qian Q，et al.OsWRKY03，a rice transcriptional activator that functions in defense signaling pathway upstream of OsNPR1.Cell Res，2005，15（8）：593－603.

［29］Jing S，Zhou X，Song Y，et al.Heterologous expression of OsWRKY23 gene enhances pathogen defense and dark－induced leaf senescence in Arabidopsis.Plant Growth Regul，2009，58：181－190.

［30］Song Y，Jing S，Yu D.Overexpression of the stress－induced OsWRKY08improves osmotic stress tolerance in Arabidopsis.Chin Sci Bull，2009，54：4671－4678.

［31］Cheng H，Liu H，Deng Y，et al.The WRKY45－2 WRKY13 WRKY42transcriptional regulatory cascade is required for rice resistance to fungal pathogen.Plant Physiol，2015，167（3）：1087－1099.

［32］Zhang Z L，Shin M，Zou X，et al.A negative regulator encoded by a rice WRKYgene represses both abscisic acid and gibberellins signaling in aleurone cells.Plant Mol Biol，2009，70：139－151.

［33］Sperotto R A，Boff T，Duarte G L，et al.Increased senescence－associated gene expression and lipid peroxidation induced by iron deficiency in rice roots.Plant Cell Rep，2008，27：183－195.

［34］黄盼盼.18个水稻OsWRKY基因的克隆和OsWRKY21功能分析.广州：中山大学，2010.Huang P P.Cloning 18 OsWRKYgenes and functional analysis of OsWRKY21.GuangZhou：Sun Yat－sen University，2010.（in Chinese with English abstract）

Expression Profiles of Rice WRKY Transcription Factor Gene Family Responsive to Exogenous Nitric Oxide Application

MENGJiao1，WANG Hai－hua1，2，3，＊，XIANGJian－hua1，JIANGDan1，PENGXi－xu1，3，HE Huan－huan1
（1School of Life Science，Hunan University of Science and Technology，Xiangtan 411201，China；2 Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metal－polluted Soils，College of Hunan Province，Xiangtan 411201，China；3 Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops in Hunan Province，Xiangtan 411201，China；＊Corresponding author，E－mail：hhwang＠hnust.edu.cn）

MENG Jiao，WANG Haihua，XIANG Jianhua，et al.Expression profiles of rice WRKY transcription factor gene family responsive to exogenous nitric oxide application.Chin J Rice Sci，2016，30（2）：111－120.

Abstract：Signal molecule nitric oxide（NO）and WRKY transcription factors are involved in many physiological processes，such as defense against stresses，development and metabolism in plants.In the present study，we investigated the expression patterns of WRKY transcription factor gene family in rice seedlings at 1，6and 12after exogenous NO treatments using Agilent rice cDNA oligo microarray.Totally，32differently expressed WRKYgenes，whose expression levels increased or decreased by at least two－fold at one time point compared with the control（T0），were identified.These WRKYgenes were mainly distributed over GroupsⅠandⅡ，among which 75%ofⅡa and 45.6%ofⅡd subgroup members were differently expressed upon the NO treatments.Moreover，15identified NO－responsive WRKYgenes，whose expression level changed by more than two－fold at least two time points among the three time points compared with the control，exhibited an earlier（1h）response to the NO treatments，and most of them（64.2%）were continually up－regulated.Prediction of gene function revealed that the NO－responsive WRKY genes were mainly involved in cellular process，metabolic process and response to stimulus of biological process，and transcription regulator activity and binding of molecular function.The analysis of metabolic pathways showed that WRKY24was involved in plant－pathogen interaction pathway.The results of microarray hybridization were largely consistent with those of quantitative real－time PCR，verifying the validity of microarray hybridization.These findings suggest that NO signaling might be involved in the regulatory functions of WRKY transcription factors，and provide a basis for further functional research for these differentially expressed WRKYgenes.

Key words：rice（Oryza sativa）；WRKY transcription factor；nitric oxide；gene expression profile

中图分类号：Q755；S511.01

文献标识码：A

文章编号：1001－7216（2016）02－0111－10

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31171803，31301617）；湖南省教育厅一般资助项目（14C0453）；湖南科技大学创新基金资助项目（S140031）。

收稿日期：2015－09－16；修改稿收到日期：2015－11－30。