血清淀粉样P物质在EV71感染小鼠肺和脑表达及其意义初探

陈　芳　何春卉　邓　力　黎晓丹



血清淀粉样P物质在EV71感染小鼠肺和脑表达及其意义初探

陈芳何春卉邓力黎晓丹

摘要目的探讨2周龄BALB/c小鼠在EV71感染后，不同分期肺和脑组织中血清淀粉样P物质(SAP)表达水平。方法2周龄BALB/c小鼠按笼号分组，实验组35只，对照组29只。实验组予1×107TCID(50)·mL(－1)的EV71病毒液0.1 mL腹腔注射，对照组腹腔注射等容量PBS液。观察小鼠的活动状态、皮疹、反应性、毛色、肢体活动及瘫痪情况等，依据实验组感染症状分为5期:精神反应期(建模后第2天)、部分瘫痪期(第3天)、全身瘫痪期(第3天)、死亡(第3～4天)和恢复期(第10天仍存活)。分别于5个分期称重实验组和对照组小鼠后处死，采集肺和脑组织以ELISA法测定SAP水平，分析不同分期SAP水平变化趋势。结果①实验组建模后第2天均出现精神萎靡、活动减少，第3天部分小鼠出现肢体运动不协调、部分肢体瘫痪，甚至全身瘫痪至死亡，提示EV71感染小鼠模型建立成功。②建模后实验组精神反应期和对照组的体重差值差异无统计学意义，在部分瘫痪期、全身瘫痪期、死亡期和恢复期，两组体重差值的差异均有统计学意义。③实验组肺和脑组织中SAP水平在5个分期表达量均与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，实验组脑组织SAP水平是对照组的2～9倍，肺组织SAP水平是对照组的1.5～8倍。实验组部分瘫痪期、全身瘫痪期和死亡期脑组织SAP水平均显著高于精神反应期(P＜0.05)，肺组织SAP水平与精神反应期差异无统计学意义;脑和肺组织恢复期SAP水平均较精神反应期显著下降，但高于对照组水平。结论SAP在EV71感染后小鼠的脑和肺组织中高表达，可能作为EV71感染后病情严重程度及预后判断的指标。

关键词肠道病毒71型;血清淀粉样P物质;脑组织;肺组织

作者单位广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心呼吸科广州，510623

尽管EV71感染引起的手足口病大部分症状轻微，为自限性，但仍有部分患儿可累及神经系统［1～3］。EV71感染患儿发生神经系统受累病理生理机制仍不明确。本课题前期应用蛋白质组学方法对轻症、重症手足口病与正常对照儿童的血清行差异表达蛋白质谱研究，发现手足口病血清淀粉样P物质(SAP)上调表达约为健康儿童的1.5倍［4］。提示SAP可能在EV71感染过程中的神经系统受累中扮演重要角色，为此本文建立EV71感染小鼠模型，探讨SAP在小鼠不同神经系统表现时期的表达情况。

1　方法

1.1EV71制备EV71感染模型(广东华南联合疫苗开发院有限公司建立，专利申请公布号: CN103374549A)，从手足口病患儿采集大便，分离病毒(EV71-C4株)，基因序列号与GenBank: AEC47477.1、AEC474811、ACD63039.1公开的序列具有较高的相似度。在非洲绿猴肾细胞［VERO细胞株(ATCC编号: CCL-81)］上传代培养，连续传3代。病毒液储存在－80℃冰箱中。用TCID50法测定滴度。

1.2动物和分组15 d孕龄无特定病原体(SPF) BALB/c小鼠12只，购自中山大学实验动物中心［许可证号SCXK(粤) 2011-0029］，在广东华南联合疫苗开发院有限公司实验动物房饲养，饲养温度20～25℃，湿度40%～60%，每日日照12 h。产仔后母鼠哺乳喂养至2周龄，每窝5～8只。BALB/c乳鼠按笼号分组(实验组35只，对照组29只)，建立EV71感染模型。本研究使用的动物均经动物伦理审查委员会审核，并按照伦理要求进行。

1.3EV71感染BALB/c小鼠模型建立实验组予1×107TCID50·mL－1的EV71病毒液0.1 mL腹腔注射，对照组腹腔注射等容量PBS液。注射当日为第0天，注射后24 h为第1天。2名实验人员密切观察小鼠的活动状态、皮疹、反应性、毛色、肢体活动及瘫痪情况等。依据小鼠EV71感染症状分为5期:精神反应期(第2天，运动减少) ;部分瘫痪期(第3天，运动不协调、前肢或后肢麻痹、弓背) ;全身瘫痪期(第3天，四肢瘫痪，濒临死亡) ;死亡(第3～4天) ;恢复期(第10天仍存活)。分别于5个分期称重后眼球采血后处死各6～8只，采集肺和脑组织备用。

1.4总蛋白提取及测定肺和脑组织剪切成合适大小(50～60 mg)，用锡纸包埋置于液氮中，快速碾碎成粉末状。取1 mL裂解液，在使用前数分钟内加入10 U蛋白酶抑制剂(PMSF)，使PMSF的最终浓度为1 mmol·L－1。每20 mg组织加入150～250 μL裂解液，冰上裂解30 min。充分裂解后，4℃12 000 g离心10 min，取上清50 μL以TBA120全自动生化分析仪(日本东芝公司)测定总蛋白水平。

1.5SAP水平测定采用酶联免疫双抗夹心法测定提取的肺和脑组织上清SAP水平，采用R＆D公司的Mouse Pentrxin 2/SAP ELISA试剂盒(批号MPTX20)，检测浓度范围0～100.0 ng·mL－1，严格按照说明书进行操作，于酶标仪(Thermo Scientific Multiskan MK3)上测定。

1.6统计学方法采用SPSS 13.0软件行统计学分析，计量数据以±s表示，实验组和对照组的组间比较采用t检验;不同观察时点间SAP水平的比较采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐性时采用LSD法，方差不齐采用Games-Howell法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1感染EV71临床表现实验组小鼠腹腔注射EV71后第2天均出现精神萎靡、活动减少，第3天开始出现竖毛、弓背等情况，部分感染鼠肢体运动不协调、部分肢体瘫痪，甚至全身瘫痪至死亡，提示EV71感染小鼠模型建立成功。

2.2实验组和对照组体重比较表1显示，建模后实验组精神反应期和对照组的体重差值差异无统计学意义，在部分瘫痪期、全身瘫痪期、死亡和恢复期，两组体重差值的差异均有统计学意义。

表1　实验组和对照组小鼠不同观察时点体重增长比较(±s)

表1　实验组和对照组小鼠不同观察时点体重增长比较(±s)

注　实验组不同分期观察体重和体重差值的差异有统计学意义，F分别为8.584和5.658，P均＜0.001

组别　　基线体重/g　　观察体重/g　　△体重/g　 t P 3.09±0.67精神反应期实验组(n =8)　 9.71±0.97　 10.18±0.84　 0.47±0.40　 0.17 0.687对照组(n =8)　 9.65±1.40　 10.20±1.25　 0.55±0.35部分瘫痪期实验组(n =8)　 9.86±1.06　 9.80±1.13　－0.06±0.14 27.42＜0.001对照组(n =7)　 9.46±1.35　 10.39±1.19　 0.93±0.48全身瘫痪期实验组(n =7)　 9.23±0.61　 9.12±0.66　－0.11±0.24 44.55＜0.001对照组(n =7)　 9.61±1.58　 10.29±1.41　 0.69±0.21死亡实验组(n =6)　 7.65±0.81　 7.76±0.48　 0.11±0.55　 6.70 0.025对照组(n =7)　 9.61±1.58　 10.29±1.41　 0.69±0.21恢复期实验组(n =7)　 10.11±1.04 10.42±1.38　 0.32±0.99 41.30＜0.001对照组(n =7)　 9.87±1.48　 13.01±1.20

2.3SAP水平变化实验组肺和脑组织中SAP水平在5个分期表达量均与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，实验组脑组织SAP水平是对照组的2～9倍，肺组织SAP水平是对照组的1.5～8倍。实验组脑组织中SAP水平在不同分期表达量不同(表2)，部分瘫痪期、全身瘫痪期和死亡SAP水平均显著高于精神反应期(t分别为5.570、2.773 和6.362，P分别为＜0.000 1、0.015 8和＜0.000 1)，恢复期SAP水平较精神反应期显著下降(t = 3.796，P = 0.002 2)，但仍高于对照组水平。实验组部分瘫痪期、全身瘫痪期和死亡期肺组织SAP水平与精神反应期差异无统计学意义(t分别为0.963、0.323和2.120，P分别为0.355、0.750和0.058)，恢复期SAP水平较精神反应期显著下降(t = 4.009，P = 0.001 7)，但仍高于对照组水平(P = 0.011 6)。

表2　实验组和对照组脑/肺组织匀浆上清中血清淀粉样P物质水平比较(ng·mL－1·mg－1，±s)

表2　实验组和对照组脑/肺组织匀浆上清中血清淀粉样P物质水平比较(ng·mL－1·mg－1，±s)

组别　　脑组织血清淀粉样P物质　t　 P　　肺组织血清淀粉样P物质　t P 3.34±0.77精神反应期实验组(n =8)　 1.76±0.59 34.06＜0.001 11.97±3.99 50.58＜0.001对照组(n =8)　 0.52±0.12　1.78±0.62部分瘫痪期实验组(n =7)　 3.14±0.31 408.9＜0.001 10.01±2.97 55.56＜0.001对照组(n =7)　 0.52±0.14　1.36±0.78全身瘫痪期实验组(n =7)　 2.66±0.68 74.37＜0.001 12.53±2.55 80.03＜0.001对照组(n =7)　 0.43±0.055　2.35±1.60死亡实验组(n =6)　 3.83±0.62 208.4＜0.001 16.91±4.14 74.57＜0.001对照组(n =7)　 0.43±0.055　2.35±1.60恢复期实验组(n =7)　 0.89±0.12 60.00＜0.001 5.07±1.33　 8.84 0.012对照组(n =7)　 0.45±0.09

注:实验组不同分期脑和肺组织血清淀粉样P物质水平差异有统计学意义，F分别为84.728和38.102，P均＜0.001

3　讨论

中国2008至2012年手足口病流行病学调查显示，80%以上的重症病例和90%以上的死亡病例是由EV71感染所致［5］。EV71感染所致的重症病例其中枢神经系统损害严重，死亡时间可发生于感染后的3.5～4 d［6］。死亡病例解剖提示脑干病变最为严重，病理特征与病毒性脑炎改变相一致，表现为神经元坏死、嗜神经现象、脑软化、胶质结节和血管套等［7］。但有学者认为神经系统过度炎症反应、儿茶酚胺过度释放，引起炎症介质相关的细胞因子风暴，最终导致脑干脑炎的发生［8］。而异常的促炎反应与抗炎反应可能与肺水肿的发生有关，心肺功能衰竭、脑脊髓炎等终末事件，均可能与神经源性肺水肿有关。

本研究显示，2周龄小鼠感染EV71后的第2天开始出现精神萎靡、活动减少，第3天出现肢体瘫痪甚至死亡，存活小鼠体重明显轻于对照组，提示EV71感染后累及神经系统并影响小鼠体重增长。

SAP与CRP在人类中的氨基酸同源超过50%，其系统发生学非常保守，提示具有重要的生理功能［9］。SAP具有结合LPS、凋亡细胞小体和DNA等物质的能力，并在固有免疫、补体活化介导的炎症反应、病原识别和清除凋亡细胞等过程中扮演重要角色［10，11］。小鼠与人的SAP相同，是主要的急性时相蛋白，其血清浓度相对稳定(约为40 μg·mL－1)。有文献报道，SAP可显著地抑制DNA诱导的巨噬细胞激活，还可抑制TLR9下游的NF-κB，RIG-I、DAI下游的IRF3转录因子的激活，并揭示SAP对先天免疫反应有着负调控作用［12～14］。Job等［15］研究发现，SAP可与甲型流感病毒株发生连接介导的抗病毒活性，抑制血凝反应、病毒感染中和反应以及抑制病毒神经氨酸酶的活性。本研究发现，实验组小鼠的肺和脑组织SAP水平均显著高于对照组，且在死亡小鼠中达到最高水平，提示SAP水平的明显升高可能与脑、肺组织损伤或炎症反应有关。

本研究还观察到脑组织SAP水平随病情加重呈增高趋势，随病情恢复，SAP水平也明显回落，提示SAP可能是导致EV71感染小鼠脑组织损伤的重要调控蛋白，可反映神经系统损伤的严重程度。虽然在肺组织中可观察到恢复期SAP水平较急性期明显下降，但在肺组织并未观察到SAP随病情加重而升高的趋势。目前已有研究证明SAP在许多疾病(如SLE等)发生发展过程起重要作用［16］，且与Alzhemer's病、Ⅱ型糖尿病、获得性和遗传性系统淀粉样变有显著关联［17，18］。SAP蛋白易于沉积于肾脏、肝脏、肺、脑等器官中，在各种炎症组织中分布增加，并具较强的与淀粉样纤维结合的能力。在手足口病神经系统损伤过程中SAP异常表达的病理生理机制仍有待进一步研究。

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(本文编辑:丁俊杰)

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《中国循证儿科杂志》编辑部

2016年1月20日

·标准·指南·

Preliminary study on the expression and significance of serum amyloid P component in the lung and brain tissues in suckling mice with enterovirus 71 infection

CHEN Fang，HE Chun-hui，DENG Li，LI Xiao-dan(Respiratory Department of Guangzhou Women and Children＇s Medical Center，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510623，China)

AbstractObjective To investigate the levels of serum amyloid P component in the lung and brain tissues in different stages in fourteen-day old BALB/c suckling mice infected with EV71.Methods Mice were randomly divided into two groups，the experimental group with 35 suckling mice and the control group with 29 suckling mice.Animals in the experimental group were injected intraperitoneally with 0.1 mL 1×107TCID(50)/mL EV71 stocks，and those in the mock control group were mock-infected with an equal amount of phosphate-buffered saline (PBS).Mice were monitored daily to observe activity，rash，reactivity，hair color，physical activity and paralysis，and experimental group was divided into 5 stages according to the signs and symptoms of infection.Mental reaction period (day 2)，partial paralysis period (day 3)，paralysis stage (day 3)，death (3－4 days) and the convalescent phase (on day 10 mice were still alive).6－8 mice that showed lethargy，weakness，limb shake，or paralysis were chosen，and killed upon symptom onset.Other survivors were monitored for up to 10 days and then killed.Tissue samples，including brain and lung，were collected from the mice.Levels of SAP were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the changing trend of SAP levels in different stages was analyzed.Results①Mice showed less activity on day 2 post-infection and some were limb shake，some even paralysis to death on day 3 post-infection.It suggested that EV71 infected mice model was established successfully.There was no significant difference in body weight between the experimental group and the control group during the period of mental reaction，but the difference was statistically significant between two groups in the period of partial paralysis，paralysis，death and recovery period.③There was significant difference of SAP levels in both lung and brain tissues between the experimental groups and controls in five stages (P＜0.05).In the experimental group，level of brain SAP wasbook=62,ebook=652－9 times than that in the control group，and level of SAP in lung tissues was 1.5－8 times than in the control group.Brain SAP levels in experimental group in partial paralysis，paralysis period and period of death were significantly higher than those in mental reaction period (P＜0.05).But it showed no statistical significance in lung between partial paralysis，paralysis，death and the convalescent.Levels SAP of recovery period decreased significantly in brain and lung tissue than those in period of mental reaction，but still higher than the level of the control group.Conclusion SAP is highly expressed in the brain and lung tissues of suckling mice infected with EV71，and it may be used as an index for judging the severity and prognosis of EV71 infection.

Key wordsEnterovirus 71;Serum amyloid P component;Brain tissues;Lung tissues

(收稿日期:2015-11-17修回日期: 2016-01-12)

Corresponding Author:DENG Li，E-mail: drdengli@126.com

通讯作者邓力，E-mail: drdengli@126.com

基金项目2014年广东省广州市卫生局研究项目: 2013J4100022

DOI:10.3969/j.issn.1673-5501.2016.01.015