滋阴清热药对狼疮鼠骨髓EMP及血清抗ds⁃DNA抗体的影响

程喜平，赖梅生，范 萍，梁康礼，胡小倩，凡 慧，陈金中

（1广州医科大学附属第一医院，广东广州510120；2南方医科大学中医学院，广东广州510515；3复旦大学遗传所，上海200433）



滋阴清热药对狼疮鼠骨髓EMP及血清抗ds⁃DNA抗体的影响

程喜平1，赖梅生2，范 萍1，梁康礼1，胡小倩1，凡 慧1，陈金中3

（1广州医科大学附属第一医院，广东广州510120；2南方医科大学中医学院，广东广州510515；3复旦大学遗传所，上海200433）

【摘 要】目的：观察滋阴清热药对狼疮鼠骨髓EMP及血清抗ds⁃DNA抗体的影响.方法：以滋阴清热方干预狼疮鼠，免疫组化方法观察EMP阳性细胞在骨髓的组织形态，定量PCR检测EMP基因表达，同时检测血清抗ds⁃DNA抗体浓度和尿蛋白.结果：狼疮模型鼠骨髓EMP阳性细胞比正常对照组密集，基因表达增高，血清抗ds⁃DNA抗体浓度和尿蛋白也更高；滋阴清热药狼疮模型鼠组与生理盐水狼疮模型鼠组EMP的基因表达组间比较明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；血清抗ds⁃DNA抗体浓度和尿蛋白也明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：EMP可能是滋阴清热药治疗SLE新的作用靶点.

【关键词】滋阴清热药；幼红细胞巨噬细胞连接蛋白；抗ds⁃DNA抗体；红斑狼疮

0 引言

国医大师禤国维教授总结的滋阴清热方对系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）有确切疗效，探索滋阴清热方作用机理具有积极意义.哺乳动物红细胞脱核现象循环发生.目前已知骨髓造血岛巨噬细胞和有核幼红细胞之间的主要连接蛋白是幼红细胞巨噬细胞连接蛋白（erythroblast macro⁃phage protein，EMP），而SLE病情重度活动时，骨髓组织可以发现噬血细胞，噬血细胞的本质是骨髓巨噬细胞吞噬有核红细胞［1－2］.据此，我们推测EMP参与SLE发病并可能是中西医药物作用的靶点，为此本研究探讨了滋阴清热方对骨髓组织EMP的影响，同时观察对血清抗DS⁃DNA抗体浓度，结果具有积极的意义.

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 16只雌性MRL／LPR狼疮鼠模型鼠，12周龄，体质量25.1～30.4（平均27.6）g，随机分为两组：滋阴清热方模型鼠组8只，模型鼠对照组8只.16只正常B6小鼠，随机分为两组：滋阴清热方中药正常鼠对照组8只，正常鼠对照组8只.动物均购自南京大学动物模型实验中心.

1.2 试验用药 滋阴清热方组：山萸肉15 g、生地黄20 g、茯苓15 g、泽泻15 g、牡丹皮15 g、青蒿8 g、甘草6 g（由广州医科大学附属第一医院中药房提供），水煎后，浓缩处理（中药含药量为94 g），生药浓度1.5 mg／mL，0.02 mL·g－1·d－1，灌胃1次／d；空白对照组：生理盐水0.6 mL，灌胃1次／d，均干预治疗6周.处死前代谢笼收集各组实验鼠24 h尿液.用考马斯亮蓝法测定尿蛋白含量.

1.3 实验方法和试剂 脱颈处死小鼠，心脏取血进行抗ds⁃DNA抗体检测，骨髓进行定量PCR和免疫组化检测.剥离四肢肌肉，前肢长骨固定石蜡做免疫组化检测，后肢剪去两端软骨露出红色的骨髓腔.冰上操作，吸取5 mL冷冻的PBS液冲洗骨髓腔，离心去上清，提取总RNA进行EMP基因表达检测，引物购自上海Life Technology公司订购，引物序列：上游5’⁃ACCCGACCCTCAAGGTGCCC⁃3’，下游5’⁃GTGGC⁃CG TCTCACGCCTCTC⁃3’.

1.3.1 RT⁃PCR 总RNA提取，用TRizol试剂按试剂盒进行；PCR实验：Roche Light Cycle 480软件，在“Template”下拉菜单中选择“kappa”，反应条件，40个循环.

1.3.2 免疫组化 小鼠后肢骨标本采用EDTA脱钙液，微波修复，二甲苯脱蜡，高压抗原修复，常规免疫组化操作.

1.3.3 血清抗ds⁃DNA抗体检测 按试剂盒说明进行相关操作在分光检侧仪上读取450 nm波长的OD值.

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0软件处理数据，采用t检验，以α＝0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 滋阴清热药对狼疮鼠骨髓组织EMP的影响

2.1.1 小鼠骨髓组织EMP免疫组化染色 狼疮模型小鼠和正常小鼠骨髓组织均可见EMP染色阳性细胞（图1）.EMP染色阳性细胞为棕黄色细胞，细胞浆、和细胞膜细胞核均被染色，但以细胞浆、细胞膜染色明显.在骨髓中，EMP染色阳性细胞均是大细胞，大细胞周围均有数目不等的有核细胞围绕，狼疮模型鼠EMP染色阳性细胞比正常鼠密度高，滋阴清热药狼疮模型鼠组EMP染色阳性细胞密度比狼疮模型鼠对照组低.

图1 小鼠骨髓组织EMP免疫组化染色

2.1.2 滋阴清热药对狼疮鼠骨髓组织EMP的mRNA表达的影响 生理盐水组的狼疮模型鼠组与正常鼠对照组EMP的mRNA表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）；滋阴清热药组狼疮模型鼠和生理盐水狼疮模型鼠组EMP的mRNA表达组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）.

表1 各实验组小鼠骨髓组织EMP的mRNA表达

2.2 滋阴清热药对狼疮鼠血清抗ds⁃DNA抗体的影响 生理盐水组的狼疮模型鼠组与正常鼠对照组抗dsDNA抗体表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表2），滋阴清热药组狼疮模型鼠和生理盐水狼疮模型鼠组抗dsDNA抗体表达组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）.同时生理盐水组的狼疮模型鼠组与正常鼠对照组尿蛋白表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表2），滋阴清热药组狼疮模型鼠和生理盐水狼疮模型鼠组尿蛋白表达组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）.

表2 各实验组小鼠血清抗dsDNA抗体情况

3 讨论

哺乳动物骨髓红细胞脱核成熟时，幼红细胞脱落的核被巨噬细胞吞噬，在SLE狼疮病情极度活动时，巨噬细胞活化并吞噬幼红细胞，出现噬血细胞［1－2］，二者可能存在一定联系.EMP是巨噬细胞和有核幼红细胞连接蛋白，EMP的缺乏会造成红细胞脱核成熟的失败［3－6］，影响巨噬细胞分化发育及极化［7］，我们推测EMP参与SLE疾病发生发展并发挥重要作用.国医大师禤国维教授根据临床经验总结了滋阴清热方，对SLE有确切疗效，阐明其机理一直是人们的努力方向.为此本研究探讨了滋阴清热方对骨髓EMP的作用变化，并以血清抗ds⁃DNA抗体浓度和尿蛋白作参考，分析滋阴清热方对骨髓EMP的作用及意义.

本研究结果显示，狼疮鼠和正常鼠骨髓EMP均可见阳性细胞，正常鼠骨髓组织中的细胞密度低，无细胞的空白背景清晰散在均匀，病理切片上的EMP阳性细胞体积形态是周围有核细胞10倍左右，棕黄色染色在细胞膜处明显加深，EMP阳性细胞周围围绕有核细胞.EMP由骨髓的巨噬细胞生成，逐渐从细胞浆向细胞膜过渡，最后聚集细胞膜发挥连接巨噬细胞和幼红细胞的作用，形成骨髓造血岛，EMP阳性细胞周围围绕有核细胞结构符合骨髓造血岛形态.

EMP的定量PCR检测结果显示，未用药的狼疮模型鼠组比正常鼠对照组EMP的mRNA表达显著性升高，说明EMP参与SLE发病；而滋阴清热药组狼疮模型鼠和未用药狼疮模型鼠组EMP的mRNA表达组间比较明显下降，说明滋阴清热药可能通过调控EMP发挥治疗SLE的作用.

我们研究滋阴清热药对狼疮鼠骨髓组织EMP的影响时，选用血清抗dsDNA抗体浓度和尿蛋白作为参照，结果显示，血清中抗ds⁃DNA抗体浓度和尿蛋白变化规律与骨髓组织中的EMP变化规律类似，相关结果结合分析提示，EMP可能参与狼疮发病机理并与狼疮病情活动及器官损害有关.

值得指出的是，巨噬细胞不仅是红细胞脱核成熟的关键功能细胞，同时也是机体的重要免疫功能细胞.我们尤其关注的是EMP由巨噬细胞产生，是红细胞脱核成熟重要功能蛋白，协助巨噬细胞吞噬红细胞脱落的细胞核［8］，而包括SLE在内的结缔组织病核心机理之一是机体产生抗核抗体，本研究提示EMP的变化规律与抗ds⁃DNA抗体变化规律及尿蛋白密切相关.我们推测EMP可能是巨噬细胞参与SLE核心发病机理并调控抗核抗体产生的功能蛋白之一，也可能是滋阴清热药等防治SLE药物作用靶点，值得我们深入研究.

【参考文献】

［1］马 杰，郑文洁，唐福林.巨噬细胞活化综合征的研究进展［J］.中华医学杂志，2006，86（27）：1941－1943.

［2］许杰州，曾庆馀，肖征宇.反应性噬血细胞综合征和系统性红斑狼疮［J］.中华风湿病学杂志，2000，4（6）：382－384.

［3］Soni S，Bala S，Hanspal M.Requirement for erythroblast⁃macrophage protein（Emp）in definitive erythropoiesis［J］.Blood Cells Mol Dis，2008，41（2）：141－147.

［4］Giger KM，Kalfa TA.Phylogenetic and ontogenetic view of erythro⁃blastic islands［J］.Biomed Res Int，2015，2015：873628.

［5］Bala S，Kumar A，Soni S，et al.Emp is a component of the nuclear matrix of mammalian cells and undergoes dynamic rearrangements during cell division［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，342（4）：1040－1048.

［6］Soni S，Bala S，Gwynn B，et al.Absence of erythroblast macrophage protein（Emp）leads to failure of erythroblast nuclear extrusion［J］.J Biol Chem，2006，281（29）：20181－20189.

［7］Soni S，Bala S，Kumar A，et al.Changing pattern of the subcellular distribution of erythroblast macrophage protein（Emp）during macro⁃phage differentiation［J］.Blood Cells Mol Dis，2007，38（1）：25－31.

［8］Mao X，Shi X，Liu F，et al.Evaluation of erythroblast macrophage protein related to erythroblastic islands in patients with hematopoietic stem cell transplantation［J］.Eur J Med Res，2013（18）：9.

·基础与转化医学·

METHODS：Lupus mice were treated with Nourishing Yin Clear⁃ing Heat herbs.The histomorphology of EMP positive cells in bone marrow were observed by immunohistochemistry，EMP gene expression were detected by quantitative PCR，and the concentra⁃tion of serum anti ds⁃DNA antibody and Proteinuria was detected respectively.RESULTS：Compared with normal control group，the lupus mice had more intensive of EMP positive cells and high⁃er EMP gene expression in bone marrow，also had higher concen⁃tration of serum anti ds⁃DNA antibody and Proteinuria.Compared with lupus mice control group，the intensive of EMP positive cells and EMP gene expression of the Nourishing Yin Clearing Heat Herbs lupus mice group was decreased，and concentration of ser⁃um anti ds⁃DNA antibody and Proteinuria was also decreased.

CONCLUSION：EMP may be a new target of treatment for sys⁃temic lupus erythematosus（SLE）by Nourishing Yin and Clearing Heat Herbs.

Effects of Nourishing Yin and Clearing Heat Herbs on bone marrow EMP and anti ds⁃DNA antibody in tissue of lupus mice

CHENG Xi⁃Ping1，LAI Mei⁃Sheng2，FAN Ping1，LIANG Kang⁃Li1，HU Xiao⁃Qian1，FAN Hui1，CHEN Jin⁃Zhong31The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong 510120，China；2Department of Traditional Chinese Medicine of Southern Medical University，Guangdong 510515，China；3State Key Laboratory of Genetic Engineering，Institute of Genetics，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai 200433，China

【Abstract】AIM：To observe the effect on erythroblast macro⁃phage protein（EMP）and anti ds⁃DNA antibody in bone marrow tissue of lupus mice with Nourishing Yin Clearing Heat Herbs.

【Keywords】Nourishing Yin Clearing Heat Herbs；erythroblast macrophage protein；anti ds⁃DNA antibody；lupus erythematosus

通讯作者：范 萍.E⁃mail：fanping18＠163.com

作者简介：程喜平.E⁃mail：cxpgz＠126.com

收稿日期：2015－11－12；接受日期：2015－11－29

文章编号：2095⁃6894（2016）02⁃08⁃03

【中图分类号】R285.5

【文献标识码】A