正交试验法优选定痛宁颗粒的乙醇提取工艺

张雷 丁安伟

摘要：目的 优选定痛宁颗粒的乙醇提取工艺。方法 以浸膏率和丹参酮ⅡA含量等综合加权评分为指标，采用L18（37）正交设计试验，并以乙醇体积分数、加醇量、浸泡时间、提取时间及提取次数作为考察因素，优选定痛宁颗粒的乙醇回流提取工艺。结果 最佳醇提工艺为药材浸泡0 h，加6倍量80%乙醇回流提取2次，提取时间3 h。结论 本研究优选的提取工艺稳定可行，为定痛宁颗粒的工业生产提供了依据。

关键词：定痛宁颗粒；醇提工艺；丹参酮ⅡA；正交试验

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0083-04

Optimization of Ethanol Extraction Technology for Dingtongning Granule by Orthogonal Design ZHANG Lei1，2， DING An-wei2 （1. Kunshan Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Kunshan 215300， China； 2. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

Abstract： Objective To optimize ethanol extraction technology Dingtongning Granule. Methods With yield of extract and content of tanshinone ⅡA as comprehensive evaluation indexes， the concentration of ethanol， the amount of ethanol， soaking time， extraction time and extraction times were selected as observing factors. Orthogonal design test L18（37） was used to optimize ethanol extraction technology of Dingtongning Granule. Results Optimum extraction conditions were as follows： soaking medicine for 0 hour； 2 times with 6 times of the amount of 80% ethanolre； flux extracted 3 hours each time. Conclusion This optimal extraction technology is stable and reliable， which can provide basis for industrial production of Dingtongning Granule.

Key words： Dingtongning Granule； ethanol extraction technology； tanshinone ⅡA； orthogonal design

定痛宁颗粒为南京中医药大学昆山附属医院的院内制剂，由丹参、白芷、蔓荆子、制川乌、制草乌、川芎、细辛等10味药组成，具有活血化瘀、祛风止痛功效，主要用于治疗血瘀气滞等引起的偏正头痛，多年临床实践显示其具有良好疗效。但目前定痛宁颗粒制备工艺只是进行简单的水提、浓缩，难以做到最大限度提取有效成分，可能影响药物疗效。因此，结合药材性质和临床功效需要，本研究对方中川芎、细辛进行挥发油提取，赤芍、红花、牛膝采用水提。而方中丹参、白芷、蔓荆子、制川乌、制草乌主要有效成分分别为丹参酮ⅡA、隐丹参酮、异欧前胡素、欧前胡素、环烯醚萜类及木脂素类化合物、乌头类生物碱，易溶于乙醇和乙醚等有机溶剂，转移率较高。本试验主要针对丹参、白芷、蔓荆子、制川乌、制草乌中的脂溶性成分，以浸膏中丹参酮ⅡA含量和干浸膏率为评分指标，采用正交试验法优选定痛宁颗粒的乙醇提取工艺。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），FA2004N型1/万电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司），BS21S型1/10万电子分析天平（德国赛多利斯公司），HHS型恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司），旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公司），SHB-ⅢS型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

丹参、白芷等药材均购于昆山市国医堂中草药房，经昆山市中医医院药剂科主任李青松副主任中药师鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》标准；丹参酮ⅡA（纯度>98%，中国食品药品检定研究院，批号110766-200619），甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），水为自制重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 浸膏得率的测定

按处方比例称取丹参12 g、白芷6 g、蔓荆子6 g、制川乌6 g、制草乌6 g，按正交试验安排进行试验，药材回流提取，过滤，滤液回收乙醇浓缩至适量，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，计算浸膏得率[1]。

2.2 丹参酮ⅡA含量测定

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（80∶20），检测波长270 nm，流速l.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL。理论塔板数以丹参酮ⅡA峰计算不低于2000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的丹参酮ⅡA对照品5.1 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.102 g/L的对照品贮备液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取“2.1”项下干浸膏约0.5 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入氯仿25 mL，回流加热1 h，过滤，滤液回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至10 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 阴性对照试验 按处方比例称取药材，按“2.1”项下方法制备成不含丹参的浸膏，再按“2.2.3”项下方法制成缺丹参的阴性对照溶液。分别吸取对照品、供试品和阴性对照溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果阴性无干扰，见图1。

2.2.5 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下丹参酮ⅡA对照品溶液各1、2、3、4、5、6 mL，分别置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，得一系列对照品溶液。精密吸取各对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。以对照品进样浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y=54 480X+9015.6（r2=0.999 7），表明丹参酮ⅡA的进样量在0.040 8～0.244 8 μg与峰面积呈良好线性关系。

2.2.6 精密度考察 以质量浓度为0.016 32 g/L对照品溶液为考察对象，在“2.2.1”项色谱条件下连续进样测定6次，测定峰面积，其RSD=1.16%，表明精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 取供试品溶液2号，在“2.2.1”项色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，测定峰面积，其RSD=1.02%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取正交试验中的13号浸膏6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下分别进样测定。结果丹参酮ⅡA的平均质量分数为0.152 7 mg/g，RSD=0.49%，表明本方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的同一份浸膏（15号样品，丹参酮ⅡA含量为0.249 7 mg/g）6份，每份0.5 g，精密称定，精密加入丹参酮ⅡA对照品溶液（含量为0.102 g/L）1 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样分析，计算回收率。结果丹参酮ⅡA的加样回收率为96.99%，RSD=1.15%，见表1。

2.3 正交试验

在预试验基础上，选择乙醇体积分数、乙醇用量、浸泡时间、提取时间、提取次数为考察因素，各因素3个水平，选用L18（37）正交表（见表2），取18份正交工艺制备的供试品浸膏约0.5 g，按照上述含量测定条件测定，计算浸膏得率和每组浸膏中丹参酮ⅡA含量。采用综合加权评分法，根据试验目的和指标成分的考量，丹参酮ⅡA的权重系数取0.8，浸膏得率权重系数取0.2，其分值为各自的数值除以18组的平均值，按公式Y=0.8Y1/Y1均+0.2Y2/Y2均（Y1为丹参酮ⅡA含量，Y2为浸

由表3中极差R值大小分析可知，各因素对醇提工艺的影响程度依次为A>D>B>C>E，提取工艺的最佳组合方案为A3B3C1D2E2。由表4的方差分析可知，乙醇体积分数对综合评分具有显著影响，其他因素则均无明显影响，虽然B3>B1>B2，但B3与B1相差不大，结合生产实际和成本角度考虑，乙醇选择6倍用量。据此确定最佳提取工艺为A3B1C1D2E2，即浸泡0 h，加6倍量80%乙醇回流提取2次，提取时间为3 h。

2.4 验证试验

按处方比例称取丹参12 g、白芷6 g、蔓荆子6 g、制川乌6 g、制草乌6 g，共3份，每份36 g，按优选的最佳提取工艺条件进行验证试验，结果见表5。

3 讨论

定痛宁颗粒有效成分种类较多，且化学性质不一，若使用单一方法提取，会造成提取效率低、提取不完全。因此，本研究针对本方活血化瘀的临床功效和有效成分理化性质，丹参所含非醌类衍生物丹参酮ⅡA是本处方主要有效成分，表现出多种药理作用，如扩血管、降低血液黏度、抗血小板聚集、改善微循环和拮抗血管紧张素Ⅱ[2]，故确定为醇提指标物质。将方中丹参有效成分丹参酮ⅡA作为本品制备工艺的考察指标，与本品的功能具有较好的相关性。

选择乙醇为提取溶媒，可以提高丹参酮ⅡA的溶出度，但如何减少其降解损失是考虑的关键，在湿热状态下乙醇浓度越高其降解越慢[3-4]。同时，在预试验中发现，随着乙醇浓度的提高，丹参酮ⅡA的含量也随之增加，并且提取液的颜色由淡黄色（40%～50%乙醇）逐渐变为橙红色（70%～90%乙醇）甚至更深，与文献[5]一致；但考察80%和90%乙醇回流提取3 h后发现，丹参酮ⅡA的含量变化不大，考虑在确保充分提取的基础上节约溶剂，故选择60%～80%乙醇为提取溶剂的浓度范围。正交试验结果也表明，最佳工艺水平是合理、可行的[6]；而采用L18（37）正交表，可以同时评估多种因素对提取效果的影响程度，更全面反映中药提取的需要。

对于供试品溶液的制备，以丹参酮ⅡA为指标，分别对提取方法（超声、回流）、提取溶剂（甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯）和提取时间（15、30、60 min）3个因素进行了考察。结果表明，甲醇超声得到的成分比较复杂，分离度差，不利于分析；乙酸乙酯提取的成分含量较低；而采用三氯甲烷回流60 min的提取效率较高，峰形良好，能与其他成分达到基线分离。说明回流提取虽然比较繁琐，但提取比较完全，能有效体现药物的作用[7-9]，故采用回流提取。

本研究对流动相的选择曾参考2010年版《中华人民共和国药典》中“丹参”项下含量测定方法采用甲醇-水（75∶25）作为流动相，但发现干扰因素较多，主峰出现拖尾，通过条件摸索，将流动相中两者的比例调整为甲醇∶水=80∶20，峰形得到明显改善，优化出符合本制剂提取工艺的色谱条件。

中药复方成分多样，以单一成分作为评价指标存在局限性，故从药效学角度考虑，本试验选用丹参酮ⅡA为指标成分，再结合浸膏得率综合评价，根据对疗效产生影响的程度赋予合适的权重系数，保证了数据指标的全面性，使分析结果更客观准确，更全面体现中药复方药效物质的作用；同时，由于本方处方量大，在确保指标性成分浸出率较高的前提下，应使得膏率维持在较小水平，以相应减少成品的日服用剂量，便于临床使用。

参考文献：

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