复方麦芽丸对多囊卵巢综合征大鼠雄激素受体及胰岛素受体基因表达的影响

王爽 杨洋博君 兰楠 陈蓉

摘要：目的 观察复方麦芽丸对多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠雄激素受体（AR）、胰岛素受体（INSR）基因表达的影响，探讨其相关作用机制。方法 采用来曲唑诱导建立PCOS大鼠模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、达英-35组及复方麦芽丸低、中、高剂量组。模型组和正常组给予生理盐水灌胃，达英-35组给予达英-35灌胃，复方麦芽丸各剂量组给予相应浓度复方麦芽丸灌胃，连续21 d。ELISA检测各组大鼠血清睾酮（T）、胰岛素（INS）水平，RT-PCR检测AR、INSR基因表达。结果 与正常组比较，模型组血清T、INS和AR、INSR基因表达明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，复方麦芽丸各剂量组血清T、INS水平和AR、INSR基因表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论 复方麦芽丸可纠正PCOS模型大鼠的内分泌-代谢失调状态。

关键词：复方麦芽丸；多囊卵巢综合征；睾酮；胰岛素；雄激素受体；胰岛素受体；大鼠

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0047-04

Effects of Compound Malt Pill on Gene Expressions of Androgen Receptor and Insulin Receptor in Polycystic Ovarian Syndrome Rat Models WANG Shuang， YANG Yang-bojun， LAN Nan， CHEN Rong （The Lab of TCM， College of Traditional Chinese Medicine， Chongqing Medicine University， Chongqing 400016， China）

Abstract： Objective To explore the effects of Compound Malt Pill on gene expressions of androgen receptor （AR） and insulin receptor （INSR） in polycystic ovarian syndrome （PCOS） rats； To discuss its relevant mechanism of action. Methods Letrozole was used to induce and establish rat models. Rats were randomly divided into normal group， model group， Diane-35 group， low-， medium- and high-dose Compound Malt Pill groups. The normal group and model group received normal saline by gavage； the Diane-35 group was given Diane-35 by gavage； Compound Malt Pill groups were respectively given different concentrations by gavage for 21 d. The levels of serum testosterone （T） and insulin were measured by ELISA， and the gene expressions of AR and INSR were measured by RT-PCR. Results Compared with normal group， the serum T， insulin and the gene expressions of AR and INSR in model group increased significantly （P<0.05， P<0.01）； compared with model group， the serum T， insulin and the gene expressions of AR and INSR in low-， medium- and high-dose Compound Malt Pill groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Compound Malt Pill can adjust endocrine-metabolic disorder in PCOS rats.

Key words： Compound Malt Pill； polycystic ovarian syndrome； testosterone； insulin； androgen receptor； INSR； rats

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）病机复杂、临床表现多样，是引起妇女无排卵性不孕常见的因素，而高雄激素血证和胰岛素抵抗是引起妇女PCOS的主因[1-2]。复方麦芽丸是重庆医科大学陈蓉教授治疗PCOS的经验方，临床研究表明，复方麦芽丸能明显改善PCOS患者的临床症状[3]。本

基金项目：重庆市卫生局重点课题（渝中医2013-54号）

通讯作者：陈蓉，E-mail：cr8093@126.com

实验观察复方麦芽丸对PCOS大鼠血清睾酮（T）、胰岛素（INS）水平的调节作用及对卵巢雄激素受体（androgen receptor，AR）、胰岛素受体（insulin receptor，INSR）基因表达的影响，探讨其相关机制，为临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

6周龄清洁级健康SD雌性大鼠48只，体质量170～190 g，重庆医科大学动物实验中心，许可证号SCXK（渝）2012-0002。饲养于重庆医科大学清洁级动物实验室，自由摄食、饮水。

1.2 药物及制备

复方麦芽丸（麦芽、熟地黄、山萸肉、巴戟天、肉苁蓉、菟丝子、仙茅、桃仁、红花、牡丹皮、当归、泽泻、知母、黄柏等），饮片均购自重庆医科大学附属大学城医院大公馆医院中药房，按常规中药煎煮方法，先将中药浸泡30 min，煎煮3次后，将滤液去渣浓缩，分别制成低（5.76 g/kg）、中（11.52 g/kg）、高（23.04 g/kg）剂量的汤剂，分装，4 ℃冰箱保存。来曲唑，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号14030656，用前将来曲唑2.5 mg溶于1%羧甲基纤维素20 mL溶液中配成浓度为0.125 mg/mL药液；炔雌醇环丙孕酮片（达英-35），拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号1407，用前研成粉末溶于蒸馏水，制成剂量为1.44 g/kg药液。

1.3 主要试剂与仪器

T试剂盒（批号20150301）、INS试剂盒（批号20150301），北京博奥森生物技术有限公司；GAPDH及AR、INSR的PCR引物、反转录试剂盒，上海沪尚生物科技有限公司。倒置白光显微镜（日本Olympus公司），低温离心机（SIGAM公司），Bio-Rad PCR扩增仪（上海拜力生物科技有限公司），移液枪、真空采血管（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.4 造模及分组

将配制好的来曲唑-羧甲基纤维素水溶液每日按8 mL/kg灌胃，参照文献[4-5]建立PCOS大鼠模型。正常组每日给予1%羧甲基纤维素溶液8 mL/kg等量灌胃，共21 d。将造模成功大鼠随机分为模型组、达英-35组和复方麦芽丸低、中、高剂量组。达英-35组给予达英-35灌胃，复方麦芽丸各剂量组给予相应浓度复方麦芽丸灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，给药体积均为1 mL/200 g。末次给药后空腹1 d，3%戊巴比妥1 mL/kg腹腔麻醉，腹主动脉取血，3000 r/min低温离心15 min，分离出的血清-80 ℃保存。分离双侧卵巢，一侧装于冻存管中，-80 ℃低温保存备用；另一侧则10%多聚甲醛溶液固定48 h，以作常规石蜡包埋切片。

1.5 指标检测

1.5.1 大鼠阴道涂片 于造模第14日进行连续2个发情周期的阴道涂片，观察大鼠发情周期变化。用移液枪将100 μL无菌生理盐水移入大鼠阴道，反复吹吸3～4次后，将吸出液涂布于清洁载波片上，伊红染色后烘干玻片，中性树脂封片并采集图像。

1.5.2 ELISA检测睾酮、胰岛素水平 冻存血清于室温平衡30 min，标准品按说明稀释5个浓度梯度，96孔板中依次加入标准品和样品、生物素标记二抗、链霉亲和素-HRP，37 ℃孵育60 min，洗板5次，加入显色液，37 ℃避光孵育10 min，加入终止液，酶标仪读取OD值，根据标准品浓度和测量的OD值得出直线回归方程，样品所得OD值代入方程式即得出样品浓度。ELISA检测大鼠T、INS水平，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.5.3 RT-PCR检测卵巢雄激素受体、胰岛素受体基因表达 根据GenBank上所查mRNA序列设计引物，引物序列：AR上游5'CGGGCAAAGGCACTGAAG AGAC3'，下游5'GCGGGCGTGTGGATGGGTAG3'，产物长度263 bp；INSR上游5'CGGCCCGATGCT GAGAACAAC3'，下游5'CCCTTGCCCCCTTTCCG ATAG3'，产物长度233 bp；β-actin上游5'TGGTGG GAATGGGTCAGAAG3'，下游5'CTTCCTTAATGT CACGCACGATTTC3'，产物长度540 bp。提取冻存的大鼠卵巢总mRNA，反转录合成cDNA。PCR反应条件：94 ℃预处理5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环45次，72 ℃延伸10 min。采用Quantity One 4.6.2图像分析系统对图像进行分析，读取的目标基因与β-actin之比即为各组卵巢组织AR、INSR基因的相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察大鼠动情周期

通过观察阴道涂片结果，判断大鼠动情周期。正常组大鼠可见规律动情周期，而造模成功后的大鼠可见动情周期紊乱或持续处于动情间期。

2.2 复方麦芽丸对模型大鼠血清睾酮、胰岛素水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清T、INS水平明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，复方麦芽丸各剂量组血清T、INS水平明显降低（P<0.05，P<0.01），达英-35组血清T水平明显降低（P<0.01），而血清INS水平与模型组比较变化不明显（P>0.05）；与达英-35组比较，复方麦芽丸低、中剂量组血清T水平明显升高（P<0.05），复方麦芽丸高剂量组血清T水平与达英-35组相近，复方麦芽丸中、高剂量组血清INS水平明显降低（P<0.05）。结果见表1。

2.3 复方麦芽丸对模型大鼠卵巢组织雄激素受体、胰岛素受体基因表达的影响

模型组AR、INSR基因表达较正常组呈高表达（P<0.01），复方麦芽丸各剂量组AR、INSR基因表达较模型组明显降低（P<0.01），达英-35组AR基因表达较模型组明显降低（P<0.01），而INSR基因表达与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）；复方麦芽丸低、中剂量组AR基因表达较达英-35组呈高表达（P<0.05），复方麦芽丸各剂量组INSR基因较达英-35组呈现低表达（P<0.01）。结果见表2。

3 讨论

PCOS病因病机比较复杂，其发病率可能受到地域、种族、饮食差异的影响。遗传、环境、精神心理等因素既能诱发PCOS产生，又可加重该病的发展。目前建立PCOS动物模型日渐成熟，雄激素造模法、孕激素联合HCG造模法、芳香化酶抑制剂来曲唑造模法等是当前公认的造模方法，它们所引起的PCOS在发病机理、组织形态和内分泌学方面均有差异。本实验选用来曲唑诱导建立PCOS大鼠模型。研究表明，来曲唑诱导建立的PCOS大鼠模型的内分泌学、组织形态学的改变符合人类PCOS患者的卵巢形态学及内分泌学改变的特征[6]。

PCOS发生的主要因素主要有高雄激素血证和胰岛素抵抗。雄激素是女性生殖发育过程所必须的重要激素之一，是雌激素合成的前体，通过与AR特异性结合而在卵泡发育、排卵、生殖过程中发挥作用。雄激素过高则会导致卵泡颗粒细胞的增殖、分化受到抑制，同时通过对芳香化酶发挥抑制作用，使卵巢雌、孕激素分泌降低，大量的AR是闭锁卵泡增加、成熟卵泡减少的重要因素。研究表明，INSR是卵泡膜细胞分泌过多雄激素的重要因子，能促进卵巢AR的合成，引起高雄激素血症[7]，高水平的INS可能会使卵泡颗粒细胞过早成熟，从而刺激卵泡膜细胞产生、分泌雄激素，同时通过降低性激素结合球蛋白水平，刺激雄激素生成[8-9]。INSR与PCOS具有高相关性，可增加PCOS患者发生代谢综合征，如糖尿病、高血压病、血脂异常、心血管疾病等风险，严重影响患者的健康[10]。

目前治疗PCOS方面，西医以降低雄激素水平、改善胰岛素抵抗、促排卵为主，中医则通过辨证论治、标本兼顾治疗。复方麦芽丸具有补肾健脾、燥湿化痰、活血化瘀的功效，方中巴戟天、肉苁蓉、菟丝子等补肾中药可缩小囊状扩张的卵泡，增加颗粒细胞、黄体数，减少闭锁卵泡数，促进正常卵泡发育成熟，改善子宫内膜情况，还可降低含量，改善卵巢局部血流情况[11-13]。泽泻等燥湿药可降低血清T、雄激素、INS和慢性炎症因子等水平，缓解胰岛素抵抗，改善卵巢功能，恢复排卵[14]。桃仁、红花等活血化瘀药可扩张卵巢局部血管、促进局部血液循环，增加纤溶酶活性，抑制血小板凝聚，降低INS和雄激素水平，促进排卵[15]。实验结果表明，复方麦芽丸能明显降低血清T、INS水平，下调卵巢组织AR、INSR基因表达，并随药物剂量的增加，调节作用亦发生相应变化。同时通过与临床治疗PCOS常用药物达英-35作用比较，显示复方麦芽丸在治疗PCOS的某些方面具有优势。复方麦芽丸对血清激素T、INS及卵巢AR、INSR基因表达的调节作用，表明其治疗作用的发挥可能是通过对T、INS、AR、INSR的调节进行的，其具体机制尚需进一步研究。

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