黄芪多糖对中波紫外线辐射皮肤角质形成细胞损伤的影响

李杨 安方玉 明海霞 刘永琦

摘要：目的 观察黄芪多糖对中波紫外线（UVB）辐射损伤皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞）的影响，初步探讨其作用机制。方法 采用UVB辐射HaCaT细胞进行造模。分为空白对照组、模型组、阳性对照组及黄芪多糖低、中、高剂量组，各药物组给予相应药物干预。MTT法测定细胞活力；生化比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量；ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）含量。结果 与空白对照组比较，模型组SOD、CAT、GSH-Px含量降低，MDA、TNF-α、IL-6含量升高（P<0.05）；与模型组比较，各药物组SOD、GSH-Px、CAT含量升高，MDA、TNF-α、IL-6含量降低（P<0.01）。结论 黄芪多糖可在一定程度上减轻UVB对HaCaT细胞氧化应激性损伤。

关键词：黄芪多糖；中波紫外线；皮肤角质形成细胞；保护作用

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0044-03

Effects of Astragalus Polysaccharides on Damage of Keratinocytes in UVB Radiation Skin LI Yang， An Fang-yu， Ming Hai-xia， LIU Yong-qi （Provincial-Level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and the Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine Research， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of Astragalus polysaccharide （APS） on damage of keratinocytes in ultraviolet B （UVB） radiation skin in HaCaT cells； To preliminarily explore its mechanism of action. Methods HaCaT cells were treated by UVB irradiated for modeling. Blank control group， model group， UVB irradiation group and low-， medium- and high-dose APS interventional groups were set up. Each medication group was given relevant medicine. MTT assay was used to determine the cell activity； GSH-Px， CAT， SOD activity and MDA content were detected by biochemical colorimetric method； contents of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the contents of SOD， CAT and GSH-Px in the model group decreased significantly， while the contents of MDA， TNF-α and IL-6 increased significantly （P<0.05）； compared with the mode group， the contents of SOD， CAT and GSH-Px in the medication groups increased significantly， while the contents of MDA， TNF-α and IL-6 were reduced significantly （P<0.01）. Conclusion APS can reduce the oxidative stress injury of UVB to HaCaT cells to some extent.

Key words： Astragalus polysaccharides； ultraviolet B； HaCaT cells； protective effect

黄芪为豆科草本植物内蒙黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var. mongholicus（Beg.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）

基金项目：甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室培育基金项目（2013年）

通讯作者：刘永琦，E-mail：liuyongqi73@163.com

Bge.的干燥根，有补气固表、托毒排脓、敛疮生肌等功效。黄芪含有多糖、皂苷、黄酮等多种有效成分，其中黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是其主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化和调节机体免疫等功效。黄芪作为增强体质、扶正固本、延年益寿之要药，古今中外研究诸多，但尚未见抗紫外线损伤的相关研究报道。本实验在体外培养皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞），以一定剂量中波紫外线（UVB）辐射建立模型，观察APS对UVB辐射损伤皮肤HaCaT的影响，初步探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 药物

APS，陕西昂盛生物医药科技有限公司，批号Uhqdt130527；使用时将APS干粉剂用生理盐水溶解，灭菌，4 ℃冰箱保存备用；维生素C片，广东华南药业有限公司，批号140406。

1.2 细胞株

HaCaT细胞株，上海轩研生物科技有限公司。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清、HyClone High Glucose DMEM、磷酸盐缓冲液（PBS），赛默飞世尔生物化学制品有限公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO），索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶，Gibco公司；过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，南京建成生物工程研究所；白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫试剂盒，北京福瑞生物工程公司。紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），UVB辐射度监视器、SUV-100UVB辐射仪（美国SIGMA公司），CO2细胞培养箱（香港力康发展有限公司），超速离心机（金坛市恒丰仪器厂）。

2 实验方法

2.1 细胞培养、分组及处理

将HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中（含青、链霉素各100 IU/mL），37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中常规培养，当细胞达90%融合时弃去培养液，PBS冲洗3遍，加2 mL胰酶，置于孵育箱中消化10 min，当细胞变圆、间隙变大时加入DMEM培养基终止消化，用无菌吸管吹打成单个细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液并加入培养基吹打成细胞悬液，以1∶2比例传代，获得足够的细胞用于实验。取对数生长期3～5代的HaCaT细胞接种于96孔板内，分为空白对照组、模型组、阳性对照组和APS低、中、高剂量组。空白对照组为正常培养细胞；模型组细胞以紫外线辐射损伤细胞[1]；APS低、中、高剂量组细胞分别在APS 100、200、400 μg/mL培养液中预孵育24 h后，分别以紫外线辐射损伤细胞；阳性对照组细胞在含有5.68 mmol/L维生素C的培养液中预孵育24 h后，紫外线辐射损伤。调整细胞密度为1×105个/mL接种于96孔培养板中，空白对照组用锡箔纸遮盖，其余各组UVB照射前吸取培养液并加入PBS覆盖细胞上层，以避免细胞干燥，暴露于15 W UVB灯管下辐照，距离20 cm，时间30 min，辐射总剂量分别为30 mJ/cm2 UVB和60 mJ/cm2 UVB后弃去PBS，再分别加入培养液，空白对照组和模型组加入等量培养液，各药物组弃去PBS，加入含药物DMEM培养液继续培养24 h，收集细胞和培养液进行检测。

2.2 MTT法测定HaCaT细胞活力

各孔加MTT 20 μL继续培养4 h终止，吸去上清液并加200 μL DMSO，常温振荡15 min，于酶标仪波长490 nm处测定各孔吸光度（OD）值，记录结果。

2.3 指标检测

收集各组细胞上清液，生化比色法测定SOD、GSH-Px、CAT、MDA含量，ELISA检测TNF-α、IL-6含量，均严格参照试剂盒说明进行检测。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 黄芪多糖对HaCaT细胞活力的影响

MTT测定结果显示，当UVB辐射为0 mJ/cm2时，各药物组细胞活力与模型组比较无明显差异，说明所加药物对正常的HaCaT细胞无毒性作用；经不同剂量UVB辐射后，模型组细胞活力明显低于APS中、高剂量组和阳性对照组（P<0.05，P<0.01），说明APS可降低UVB对HaCaT细胞活力的抑制作用。结果见表1。

4.2 黄芪多糖对HaCaT细胞相关指标含量的影响

与空白对照组比较，模型组SOD、CAT、GSH-Px含量均显著降低，MDA、TNF-α、IL-6含量均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，APS高、中剂量组和阳性对照组SOD、GSH-Px、CAT含量均显著升高，MDA、TNF-α、IL-6含量均显著降低（P<0.01）；APS中、高剂量组和阳性对照组比较，各项指标无明显差异。结果见表2、表3。

5 讨论

UVB主要的靶细胞是HaCaT细胞，UVB可造成HaCaT细胞生物学特性的一些改变，导致各种皮肤病。因此，UVB在紫外线对皮肤损伤中占重要地位。

中医学认为，正气亏虚，邪气乘虚而入，皮肤病的发生是机体脾肺功能下降，调节失衡所致；现代医学认为，当免疫系统失去监控功能就会导致疾病的发生，这一观点与中医学理论相一致。近年来，中药对皮肤的光保护作用日益受到重视和应用。研究发现，黄芪制剂有抗皮肤老化和抗紫外线的作用[2]。依据黄芪“走表”的中医理论，辨证采用“补法”调节脾肺之气，运用其调节人体免疫功能的作用，治疗多种皮肤病均取得了满意的疗效[3]。

暴露在皮肤的HaCaT细胞很容易受到各种物理、化学因素的侵袭并产生氧化应激性的损伤。正常的皮肤细胞有较完善的氧化/抗氧化系统，这些防御系统包括SOD、GSH-Px、CAT等。SOD是机体有效清除活性氧重要酶类之一，保护细胞免受损伤，是体内抗氧化酶体系的重要组成部分，其含量可间接反映机体清除氧自由基的能力。张氏等[4]研究发现，APS通过提高SOD含量，加强对氧自由基的清除作用，从而发挥其抗氧化的作用。GSH-Px是机体内存在的催化H2O2分解的酶，可保护细胞膜结构、功能的完整；CAT是一种酶类清除剂，是生物防御体系的关键酶之一，它促使H2O2分解为氧分子和水，清除机体内的H2O2，可使细胞免于遭受H2O2的毒害；MDA含量可反映机体内脂质过氧化程度，间接反映受自由基攻击的严重程度，它是氧化过程中的最终产物之一，是氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引起脂质过氧化反应而形成的过氧化脂质降解产物。HaCaT细胞在UVB辐射后可释放TNF-α、IL-6、IL-1β等多种促炎症因子。TNF-α是细胞因子网络中心之一，可导致其他多种细胞因子的释放引起细胞凋亡；IL-6是角质形成细胞与成纤维细胞相互作用环路的中介物质，是机体免疫防御、炎症损伤中的重要介质，其主要免疫学功能是加强其他细胞因子的效果，IL-6分泌或基因表达异常均可导致一系列疾病。本实验结果显示，APS能提高HaCaT细胞SOD、GSH-Px、CAT的含量，降低MDA、TNF-α和IL-6的含量。

综上，APS可在一定程度上减轻UVB对HaCaT细胞氧化应激性损伤，增强细胞抗氧化能力，降低炎症细胞因子的分泌，减轻细胞受损程度。

参考文献：

[1] 高薇，侯微，李伟，等.UVB辐射HaCaT细胞损伤模型的建立[J].中药药理与临床，2014，30（5）：136-139.

[2] 陈斌，康健，吕中明，等.黄芪甲甙对中波紫外线损伤皮肤角质形成细胞的保护作用[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2009，8（1）：1-4.

[3] 沈晓峰，房新志，宋东.黄芪在皮肤病治疗中的应用[J].新疆中医药， 2000，18（2）：57-59.

[4] 张灼，陈立新，宋崇顺，等.黄芪多糖对大鼠心肌缺血-再灌注损伤后的保护作用[J].中国中医药信息杂志，2007，14（2）：33-34.