大果木莲种子萌发及其生理特性1)

李宗艳　　　　　　肖娟

(西南林业大学，昆明，650224)　　　　(云南森林自然中心)



大果木莲种子萌发及其生理特性1)

李宗艳肖娟

(西南林业大学，昆明，650224)(云南森林自然中心)

摘要以大果木莲种子为材料，比较赤霉素(GA3)浸种、磨破种皮和层积40 d种子萌发特性和萌发生理代谢差异，结果表明：冷藏1个月的大果木莲种子在较佳萌发温度25 ℃/15 ℃(昼/夜)下，种子萌发率仅为21.33%；当GA3质量浓度达到800 mg·L(-1)时，种子萌发率均超过53%，且差异不显著，萌发率受温度的影响不大；GA3处理能有效提高在非萌发适温下种子的发芽指数，但对萌发适温下的种子发芽指数无显著促进效果。磨破种皮和层积40 d处理对提高种子萌发率无显著作用。随着萌发进程，800 mg·L(-1)GA3处理能显著地提高种子内可溶性糖质量分数和过氧化氢酶(CAT)活性，清除体内的丙二醛(MDA)，但对过氧化物酶(POD)活性无明显影响；层积组和对照组种子的可溶性糖质量分数、CAT和POD活性随萌发进程的变化无明显差异，仅在清除MDA的速度上，层积组要优于对照处理。在大果木莲种子萌发的生理代谢变化中，CAT活性与可溶性糖质量分数变化呈极显著正相关，可溶性糖质量分数与MDA质量摩尔浓度、CAT活性与MDA质量摩尔浓度之间均呈极显著负相关；经主成分分析，CAT、POD活性的变化对种子发芽的贡献较大。

关键词大果木莲；种子萌发率；过氧化氢酶；生理代谢

分类号Q945.53

Seed Germination and Physiological Characters ofManglietiagrandis

Li Zongyan

(Southwest Forestry University, Kunming 650224, P. R. China); Xiao Juan(Yunnan Nature Conservation Center)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：37-41.

We studied the germination characters and physiological metabolism ofManglietiagrandisunder the GA3-soaked, seed coat-destroyed and 40-d cold stratification treatments. The germination rate of 30-d cold storage seeds reached to 21.33% even under the appropriate temperature. Seeds soaked with GA3had higher germination rate which was related with its concentration and temperature. Seed germination rates were above 53% and had no significant difference under all three temperature when seeds were soaked with 800 mgL-1GA3. Germination index could be effectively increased in no suitability temperature, but not increased significantly in an appropriate temperature. Germination rate had no significant difference under seed coat-destroyed and 40-d cold stratification treatments. Soluble sugar content and CAT activities were increased effectively and MDA was quickly cleaned under GA3treatment, while POD activity was kept stably. But soluble sugar content, CAT and POD activity had no significant difference between cold stratification and contrast treatment, except a quick clearance of MDA in cold stratification. CAT activity had a significant positive-correlation with soluble sugar content. Otherwise, there was a negative correlation between soluble sugar content and MDA content, and between CAT and MDA. By the principle component analysis of four physiological indexes, CAT and POD activity had much more contribution rate to seed germination.

KeywordsManglietia grandis; Germination rate; CAT activity; Physiological metabolism

种子的萌发受种子特性和环境因素的影响，种子萌发数量决定种群的更新能力。濒危物种就是不能依靠繁殖来维持野外生存的最小种群数量的物种。木莲属是木兰科中最原始的属，多数濒危种的自然分布区都较窄，在天然林中为星散分布，现已知的木莲属多数种子内源休眠期较长，而胚的活力需要高湿条件造成种子野外萌发率较低，种群的自然更新较慢[1]。

大果木莲(Manglietiagrandis)属木兰科(Magnoliaceae)木莲属(Manglietia)的常绿阔叶树种，为我国特有种的珍稀濒危物种，属国家Ⅱ级重点保护野生植物[2]。大果木莲树形优美，花大色艳，是非常珍贵的庭院观赏树种，现仅零星分布于云南东南部和广西西南部局部狭小区域[3]，大果木莲种子萌发时间较长，林下幼苗和幼树极为罕见，自然繁殖更新能力严重衰退[4]。

活种子是否能萌发取决于其休眠程度和环境条件。种子的休眠分为内源休眠、外源休眠和综合性休眠[5]。外源休眠一般是由于植物种皮结构和化学组成导致种皮透气性较差；而内源休眠则是由于种胚发育未全或未分化导致不具备发芽能力、种子内含有抑制萌发的物质所致。木莲属植物中，已知巴东木莲(M.patungensis)属于内源休眠和形态休眠共同引发的综合性休眠[6]，而红花木莲(M.insignis)和华盖木(M.sinicum)种子则是生理休眠[7-9]。潘睿等[10]对新鲜的大果木莲种子的发芽状况进行了研究，其胚已育但未完全分化，种子内含有的发芽抑制物对发芽率无明显影响，萌发时间较短，在适宜温度下种子发芽率可达82%，属于浅生理休眠型的种子。依据野外调查，大果木莲发芽周期较长，发芽率变异系数较大[11]，其形成原因值得深入研究，目前未见其种子萌发生理代谢研究。本研究通对观测冷藏大果木莲种子在不同处理和温度下发芽率和发芽指数的变化，并检测不同处理方式对种子萌发重要生理指标的动态变化，探讨其种子萌发特性和生理代谢差异，为其种苗繁育和迁地保护提供有效的理论依据。

1材料与方法

试验材料大果木莲种子于2013年9月份采集自马关古林箐省级自然保护区内，种子千粒质量为102.997 9 g，用0.2%的高锰酸钾(KMnO4)溶液浸种消毒后于通风干燥处摊晾，阴干后放入冰箱中5 ℃冷藏1个月后供试验用。

分别采用GA3浸种、物理破损种皮、层积方式处理种子。分别用100、200、400、800 mg·L-1GA3浸种48 h；沿种脐用锉刀刚好磨破种皮；鉴于大果木莲种子为浅度生理休眠类型[10]，前人已经做过60、120 d层积种子发芽处理，本试验选择在5 ℃层积种子40 d，将处理后的种子置于有滤纸的培养皿中，放在光照培养箱中分别于25 ℃、25 ℃/15 ℃(昼/夜)、20 ℃/10 ℃(昼/夜)进行24 h的发芽试验。每个处理用50粒种子，做3个重复。对照处理为未经处理、常温保存的种子。

种子生活力测定采用TTC染色法[12]，种子萌发以胚根突破种皮1 mm为标准，统计种子发芽率和发芽指数。用以下公式计算：

发芽率=(规定时间内生成正常幼苗的种粒数/供试种子数)×100%。

发芽指数(GI)=∑(Gt/Dt)，式中,Gt为相应各日生成正常幼苗的种粒数；Dt指发芽时间。

从培养箱中25 ℃/15 ℃条件下分别取对照、800 mg·L-1GA3浸种和低温层积40 d种子在第0、10、13、16、19 d进行生理指标(可溶性糖质量分数、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、丙二醛质量摩尔浓度)测试，方法参阅张治安等[13]方法。

对种子生理指标和发芽率进行方差分析，并采用Duncan法进行多重比较。采集发芽前期4个种子生理指标变化数据，使用SPSS13.0软件进行两两指标间相关性研究，并进行主成分分析。

2结果与分析

2.1不同处理对种子萌发的影响

经TTC染色检测，大果木莲种子生活力达67.70%。对照组在25 ℃条件下，种子在23 d开始萌发，60 d时萌发率为6.77%；在25 ℃/15 ℃变温环境中，种子在28 d始发，在60 d时的萌发率为21.33%；在20 ℃/10 ℃变温处理下，种子在38 d始发，在60 d时发芽率为6.67%。在25 ℃/15 ℃条件下大果木莲种子萌发率与另两个温度条件下的存在显著差异。

GA3处理能有效地提高种子的发芽率。在相同温度条件下，种子萌发率随着GA3质量浓度增大而提高，且经不同质量浓度GA3处理的种子萌发率差异达到显著水平(表1)。当GA3为800 mg·L-1时，种子萌发率达到最高，均超过50%，且在3个不同的温度水平下，种子萌发率差异都不大，这表明当GA3质量浓度达到有效解除种子休眠时，温度处理对种子萌发的影响不大。而在低质量浓度GA3条件下，种子萌发率与温度水平有一定的相关性，相同质量浓度种子萌发均在25 ℃/15 ℃变温处理中更高，在此变温环境中更有利于提高种子萌发率。

表1　经不同处理60 d时大果木莲种子萌发差异

注：表中数据为平均值±标准差；同列数字后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

从不同GA3处理对种子发芽指数的变化分析可看出(表1)，与对照组比较，在3个不同温度条件下，GA3处理都导致种子发芽指数提高，不同质量浓度GA3都能缩短大果木莲种子发芽时间，处理的种子在20 d左右萌发，种子萌发所需时间短于对照，群体发芽整齐度高，以质量浓度800 mg·L-1的发芽指数最大，均超过0.22。但GA3对大果木莲发芽指数的有效提高与萌发温度相关，在25 ℃、20 ℃/10 ℃条件下的促进作用就尤为显著，与对照组的发芽指数比较，差异均达到显著水平。上述结果说明，GA3能有效地促进种子早萌发和提高种子萌发率和萌发的整齐度。

磨破种皮处理在25 ℃/15 ℃条件下，对种子萌发有一定的促进作用，种子萌发率为25.33%，高于对照的21.33%，经方差分析，效果不明显。在25 ℃下，低于对照组的萌发率(6.67%)，在20 ℃/10 ℃下,稍高于对照组，但差异不明显(表1)。

由表1可以看出，大果木莲种子经层积40 d时，于23 d开始萌发，在25 ℃/15 ℃条件下，萌发率最高，为28.00%；25 ℃时的萌发率为24.00%，在20 ℃/10 ℃条件下，萌发率最低，仅有20.00%。层积处理比对照组的萌发率有所提高，但在25 ℃/15 ℃环境中，层积处理效果与对照处理无显著差异。与前人所做的层积60 d，相同温度条件下的种子萌发率比较，处理40 d的萌发率明显低，与层积120 d的结果差异不大[10]。

磨破种皮和种子层积两种处理在不同温度下种子发芽指数均低于0.01，种子发芽数量少，周期长。

2.2种子萌发过程中可溶性糖质量分数的变化

种子吸胀处理至发芽前期，种子体内的糖代谢主要涉及淀粉水解酶活性增强，导致种子贮藏淀粉水解，产生可溶性糖，为种子萌发提高能源物质。由表2可见，在对照、低温层积、GA3处理方式下大果木莲种子萌发期间可溶性糖质量分数从0～16 d缓慢上升，从16～19 d均急剧上升，对照处理的可溶性糖质量分数在0 d时为357.17 mg·g-1，到13 d时为441.33 mg·g-1，19 d时上升到606.50 mg·g-1；可溶性糖质量分数随着时间变幅最大的应为GA3处理组，经800 mg·L-1GA3处理的在13 d时为577.33 mg·g-1，到19 d时上升至870.00 mg·g-1。低温层积和对照处理在前期(1～13 d)可溶性糖质量分数上升幅度较小，两者间差异不明显。

表2　不同处理条件下4个生理指标随时间的变化

注:同行数字后不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3种子萌发过程中丙二醛质量摩尔浓度的变化

种子休眠过程中，由于O2-·、·OH活性氧的积累，造成膜脂过氧化不断加强，种子在吸胀期间，种子体内膜脂过氧化物的清除直接关于到种子的发芽。丙二醛是脂质过氧化的产物，其高低可表示种子脂质过氧化程度的高低。

膜脂过氧化产物MDA质量摩尔浓度在0 d时最高，为0.13 μmol·g-1，随着萌发进程呈下降趋势，以GA3和层积处理对种子体内丙二醛积累的清除较为明显，MDA质量摩尔浓度0～10 d下降较快，10 d时，经800 mg·L-1GA3处理的MDA质量摩尔浓度降为0.05 μmol·g-1，经低温层积处理的MDA质量摩尔浓度降为0.09 μmol·g-1，与对照之间差异显著。从13～16 d，经层积和GA3处理组，体内MDA质量摩尔浓度变化不大，两者间差异不明显。至19 d时，三组处理的MDA质量摩尔浓度下降显著，且组间无差异。对照组MDA质量摩尔浓度从1～13 d变化不大，13～19 d MDA质量摩尔浓度下降急剧，16 d时降至0.002 9 μmol·g-1，19 d时MDA质量摩尔浓度为0.003 3 μmol·g-1，与其余两组接近(表2)。

2.4种子萌发过程中过氧化氢酶活性的变化

大果木莲种子萌发期间，如表2所示，在对照处理、GA3和低温层积3种处理下，过氧化氢酶活性整体呈上升趋势。在0 d时CAT活性为0.14 mg·min-1·g-1。0～10 d，3组处理的CAT上升缓慢，13 d时CAT活性迅速上升，其中GA3处理组的活性达到最大，其次为对照组，分别为1.19、0.93 mg·min-1·g-1，3组间活性差异达到显著水平。但在16 d时，GA3和对照组的CAT活性比13 d的略有下降，当19 d时，经GA3处理的和对照的活性差异不明显，但比层积的活性有显著差异。总体来说，低温层积处理的CAT活性缓慢上升，变幅小于上述两种处理的，10 d时CAT活性为0.34 mg·min-1·g-1，13 d时为0.70 mg·min-1·g-1，16 d时为0.81 mg·min-1·g-1，19 d时上升幅度较小，仅增加了0.11 mg·min-1·g-1。

2.5种子萌发过程中过氧化物酶活性的变化

从表2可以看出，对照组POD活性随时间的变化幅度是较显著的，0～16 d POD活性一直在上升，在10 d时，POD活性为8.18 U·g-1，后期上升的幅度较大，16 d时，POD活性迅速上升，达到高峰，为17.26 U·g-1，至19 d时POD活性下降至10.31 U·g-1，与其他两个组比较，POD活性都达到显著差异；层积处理组的POD活性随时间一直在缓慢提高，10 d时POD活性为9.39 U·g-1，16 d时POD活性为12.26 U·g-1，至第19 d时POD活性几乎无变化；仅有经GA3处理的POD活性变化不大，从10～19 d几乎没有变化，第19 d时略有下降，降至7.95 U·g-1。

2.6各生理指标间的关联性

通过对大果木莲种子萌发过程中4个生理指标变化的关联性研究，依据Pearson相关系数的显示(表3)，种子内过氧化氢酶活性与可溶性糖质量分数呈极显著正相关，相关系数达到0.727，与丙二醛质量摩尔浓度呈极显著负相关，相关系数为-0.780；而种子萌发期可溶性糖质量分数变化还与丙二醛质量摩尔浓度呈极显著的负相关。但过氧化酶活性与任一指标变化都无明显的相关性。这些结果反映了大果木莲种子萌发过程糖代谢与膜质氧化程度和体内保护酶活性都有明显的相关性。

表3　生理指标间的相关性

注：** 表示在0.01水平上差异极显著。

2.7主成分分析

对大果木莲4个生理指标在发芽前期变化数据进行主成分分析，结果显示：前2个主成分的累积贡献率达到了91.364%。第1和第2主成分的贡献率依次为65.449%、25.915%。依据第1和2主成分的累积贡献率所占的百分率数据说明，各生理指标特征根值能较好地代表各指标变异的贡献。通过第1和2主成分的累积贡献率综合分析，过氧化物酶和过氧化氢酶的变异贡献率较大，而可溶性糖质量分数的变异贡献率较小(表4)。说明种子萌发过程中，体内保护酶活性的变化具有重要的生理价值。

表4　大果木莲种子萌发期生理指标变异的主成分分析

3结论与讨论

GA3能有效地打破大果木莲种子的休眠，种子发芽率随其质量浓度的增大而提高，在低质量浓度(100～400 mg·L-1)条件下，种子萌发率与温度相关，但都比对照组显著提高，以25 ℃/15 ℃温度的为好。当GA3质量浓度达到800 mg·L-1时，萌发率最高，种子发芽率在不同萌发温度下的差异不显著。磨破种皮和层积40 d处理对大果木莲的萌发率无明显提高。在3组处理中，种子萌发以25 ℃/15 ℃变温条件下为优。

在自然界中，种子的休眠通常与种皮机械障碍、胚发育不完全和种子内存在抑制萌发的关键物质等有关。新鲜大果木莲的种胚属于分化但未完全发育的类型[10]，种胚中含有一定的抑制萌发物，但仅对豆芽发芽速率有影响，且对发芽率无明显影响[10]。本试验对大果木莲种皮进行破坏处理，但对提高种子萌发率无显著影响，说明了大果木莲种子的休眠受其种皮致密结构的影响应不大；而层积40 d对提高种子发芽率无显著作用。大果木莲种子属于条件休眠，浅休眠的类型。具有条件休眠的种子典型特点就是在适合非休眠种子的一系列物理环境条件下不能萌发[14]。本试验中，大果木莲种子在冷藏1个月后，尽管置于发芽适温25 ℃/15 ℃中发芽率仅为21.33%，远低于新鲜种子的82%[10]，可能是由于种子重新进入次生休眠状态。使用GA3处理就能有效提高种子萌发率，在高浓度的GA3处理条件下会使其萌发温度条件扩展，在25 ℃、25 ℃/15 ℃、20 ℃/10 ℃下萌发率无显著差异，具备了作为条件休眠的种子在适宜处理下萌发条件扩展的特性。这解释了尽管大果木莲在人工条件下种子萌发无障碍，但在自然状态下却表现出天然更新困难的本质原因，即种子在自然状态由于温度条件影响极易进入次生休眠。

相关研究表明：膜系统变化会影响种子生活力[15]。当不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应时，膜质过氧化加强，可促发超氧自由基(O2-·)和羟自由基(·OH)活性氧释放，氧化损伤可引起MDA生成量增加，此时若体内保护酶系统如SOD、CAT、POD活性下降，就会直接导致种子活力下降。这些酶是种子自身的抗氧化系统，它们的活性高低与种子贮藏后的活力高低密切相关。普遍存在着SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶可以协同合作清除活性氧自由基，其中CAT和POD有相似的机理，可以除去生理系统中的H2O2，从而减轻活性氧自由基对植物的危害[16]。有研究表明，经老化处理的种子在吸胀萌发过程中，SOD活性比对照低[17]；大多数报道表明，经过GA3处理的种子，过氧化物酶和过氧化氢酶的活性均高于对照[18-19]，抑制膜脂过氧化作用，两者活性变化具有一致性。应用激素能保持高水平的SOD、CAT活性[19]；但也有少数研究表明，种子衰老期CAT活性迅速下降，而POD活性却上升[20]。在本试验中，GA3组处理种子，CAT活性有显著提高，但POD活性无变化；对照组和层积组种子内CAT、POD活性变化具有一致性，在种子萌发前期两者活性都迅速上升。POD、CAT活性大小关系到MDA的清除，相关性研究结果表明，CAT活性与MDA质量摩尔浓度呈极显著的负相关，说明了大果木莲种子萌发期，CAT活性主要涉及清除MDA能力的大小。而POD活性与MDA质量摩尔浓度无显著相关性，这两种酶活性变化不一致是否存在还原共同底物的竞争作用有待于进一步研究。

种子萌发过程中，淀粉在淀粉水解酶作用下水解为可溶性糖，为萌发提供能源物质。现已知GA3的生理作用之一就是活化α-淀粉水解酶的活性[21]。在GA3处理组，种子萌发前期体内可溶性糖质量分数急剧上升，与另两处理组的结果差异极显著，应与GA3处理迅速地促进淀粉的水解有关。可溶性糖作为呼吸底物为种子萌发过程提供充足的能源物质是至关重要的。本试验中可溶性糖质量分数变化与MDA质量摩尔浓度变化呈极显著的负相关，说明种子膜质氧化程度——MDA质量摩尔浓度会影响糖代谢过程，其作用机理值得深入研究。从4个生理指标的变异贡献来看，种子萌发过程POD、CAT活性变异具有重要作用，说明种子萌发活力变化研究选用保护酶活性作为指标具有重要的价值。

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收稿日期：2015年10月18日。

第一作者简介：李宗艳，女，1974年4月生，西南林业大学园林学院，副教授。E-mail：lizyan74@sina.com。通信作者：肖娟，云南森林自然中心，工程师。E-mail：274943046@qq.com。

1)西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验开放基金资助(BC2010F02)、云南省级重点学科园林植物与观赏园艺重点实验室开放基金资助(50097401)。

责任编辑：任俐。