外源H2O2对低温胁迫下柑橘叶片抗寒性的影响

蒋景龙

(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西汉中 723001)



外源H2O2对低温胁迫下柑橘叶片抗寒性的影响

蒋景龙

(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西汉中 723001)

摘要：以柑橘品种‘日南1号’离体秋稍为试材，采用Hoagland营养液培养方法，研究添加不同浓度H2O2处理对4℃低温胁迫下柑橘生长状态和叶片细胞相对电导率(REC)、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量以及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性等生理指标的影响，筛选缓解柑橘低温伤害的最佳H2O2处理浓度,探讨外源H2O2处理对柑橘耐寒能力影响机制。结果显示：随低温胁迫时间的延长，各处理组柑橘叶片卷曲和叶片细胞膜伤害程度均逐渐加重；外源施加0.2 和1.0 mmol·L(-1) H2O2处理均能缓解低温胁迫引起的叶片卷曲和萎蔫，降低叶片中REC和MDA的升高，减少叶片细胞中内源H2O2的积累，提高渗透调节物质脯氨酸的含量和抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性，并以1.0 mmol·L(-1)H2O2缓解效果更为显著。研究表明，4 ℃低温能够引起柑橘离体秋梢叶片卷曲、枯萎、脱落和细胞膜伤害症状，外源1.0 mmol·L(-1)H2O2可以通过提高叶片的脯氨酸含量和SOD、CAT和POD抗氧化酶活性，有效缓解低温对柑橘叶片细胞膜的伤害，从而增强其抗寒性。

关键词：柑橘；低温胁迫；外源过氧化氢；抗寒性

柑橘(CitrusreticulataBlanco.)为芸香科柑橘亚属常绿小乔木或灌木，主要分布在热带和亚热带地区，性喜温暖湿润气候。柑橘在陕西汉中、安康等地分布广泛，栽培历史悠久，是陕南地区农业的主导产业之一。陕南地区地处亚热带的北缘，也是中国柑橘种植的最北缘，冻害的多发地带。近几年陕南柑橘连续遭受周期性大面积冻害。2012～2013年陕南地区发生30年一遇的持续低温天气，柑橘受冻面积占全省柑橘总种植面积的1/4，汉中主产区受灾尤为严重[1]。研究抗冻机制或筛选良好的抗冻剂对提高柑橘的抗冻性和减轻冷冻伤害具有重要意义[2]。众所周知，过氧化氢(H2O2)是生物体内各种生理代谢的副产物，也是活性氧(Reactive oxygen species,ROS)中最稳定的一种，一直被认为是对细胞产生毒性的代谢物，近些年发现它在生物体内还可以作为一种信号分子，在信号转导过程中扮演重要角色，如诱导气孔关闭、参与根的向地性生长、细胞壁木质化、细胞程序性死亡、侧根的发育以及花粉管和柱头相互作用等[3]。当植物遭受轻度的生物或非生物胁迫时，产生的H2O2能够通过参与信号转导调节植物的代谢(如光合作用、呼吸作用、蒸腾作用)及保护系统(如抗氧化胁迫的酶系统与非酶系统)，使植物获得环境胁迫或生物胁迫的抗性[4]。很多研究表明H2O2与Ca2+和NO一样可以通过外源喷施或向培养液中添加的方式提高植物的抗逆性，近几年越来越多的学者开始研究通过施加H2O2溶液来提高一些作物抗性，例如通过外源施加H2O2提高小麦、水稻、大豆和玉米的耐盐性、耐冷冻性和耐旱性等[5-7]。然而，针对不同的植物和不同的胁迫处理，能有效提高抗逆性作用的H2O2浓度差别较大，本研究拟通过分析不同浓度H2O2处理对4 ℃低温胁迫下‘日南1号’柑橘秋稍生长状态和叶片细胞膜伤害程度、渗透调节物质含量和抗氧化酶活性等指标影响，筛选缓解柑橘低温伤害的最佳H2O2处理浓度并探讨外源H2O2处理对柑橘耐寒能力影响机制，以期为提高柑橘抗冻能力提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料培养与H2O2处理

供试材料为柑橘品种‘日南1号’，由汉中泛亚绿色食品有限公司提供，在陕南柑橘脱毒良种苗木繁育基地保存。剪取生长整齐、健壮的柑橘秋稍培养在Hoagland营养液中，置于(4±0.5)℃的低温培养箱中胁迫10 d，空气相对湿度为80%，光照时间为12 h/12 h(昼/夜)，光照度为1 000 lx。将4 ℃低温培养的柑橘秋稍分为2组，一组向Hoagland营养液中分别加入0.2(T1)、1.0(T2)和5.0 mmol·L-1H2O2(T3)溶液作为处理组，不添加H2O2溶液仅进行低温处理的作为对照组(CK)，每个处理设置3瓶，每瓶培养3个柑橘秋稍。分别在H2O2处理的第2、4、6、8和10 d进行叶片采样，一部分叶片直接用于H2O2组织化学染色和相对电导率的检测，其余每份均取0.5 g用锡箔纸包好保存在-80 ℃冰箱中以检测其他生理指标，所有指标均设置3次重复。

1.2测定指标及方法

1.2.1形态观察将培养在Hoagland营养液中的对照组(CK组)和各处理(T1、T2和T3)组柑橘离体秋稍分别在处理的第2、4、6、8和10天进行观察，并利用Canon数码照相机EOS600D进行数码拍照。

1.2.2叶片相对电导率将对照组和处理组的柑橘叶片分别用自来水和蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗1次后滤纸吸干表面水分，将叶片避开主脉剪成长条，快速称取3份，每份0.1 g，分别置于含20 mL去离子水的刻度试管中，室温下浸泡处理12 h，用雷磁DDSJ-308F型电导率仪测定叶片浸提液电导率，记为R1；然后将装有叶片浸提液的试管放入水浴锅沸水浴30 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导率，记为R2，最后计算叶片相对电导率(REC)。REC=(R1/R2)×100%。

1.2.3H2O2组织化学定位与染色分别取对照组和处理组的柑橘叶片进行H2O2组织化学定位与染色，染色方法参照Jiang等[8]的方法。用H2O2的特异性染色试剂二氨基联苯胺(3,3-Diaminobenzidine，DAB)检测叶片中内源H2O2的组织定位，依据叶片染色范围和染色程度判断柑橘叶片内源H2O2组织分布变化和积累程度。

1.2.4其他生理指标叶片丙二醛(MDA)含量测定参照Farooq等[9]的方法，叶片中脯氨酸含量与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 和 过氧化物酶(POD)活性均参照李玲等[10]的方法测定。

1.3数据处理

实验数据采用SPSS16.0软件进行统计分析。

2结果与分析

2.1外源H2O2对低温胁迫下柑橘离体枝条叶片形态的影响

就对照组而言，在4 ℃低温胁迫处理2 d时，柑橘离体枝条叶片无明显变化(图1,A)；在低温处理4～6 d时，部分柑橘叶片开始出现卷曲(图1,B、C)；处理8 d时，80%柑橘叶片出现卷曲，卷曲程度明显比处理4～6 d时严重(图1,D)；当低温处理10 d时，所有的叶片全部出现卷曲，部分叶片甚至开始干枯死亡(图1,E)。T1组观察结果显示，低温处理4 d以前，柑橘叶片无卷曲症状出现(图1,F、G)；处理6 d时开始出现叶片卷曲(图1,H)，但卷曲的叶片数量和卷曲程度明显比同期对照组要轻，处理8和10 d时也未出现大部分叶片卷曲或干枯现象(图1,I、J)，由此表明施加0.2 mmol·L-1H2O2有效缓解了低温胁迫对柑橘的伤害。当外源施加H2O2浓度增加至1.0 mmol·L-1时(T2组)，其缓解低温胁迫对柑橘的伤害作用更加显著，低温处理10 d的整个过程中几乎没有叶片卷曲的现象出现(图1,K～O)。T3组观察结果显示，5.0 mmol·L-1H2O2不仅没有减轻低温胁迫对柑橘造成的伤害，反而对低温胁迫的柑橘造成了更严重的伤害，在处理4 d就开始出现了大部分叶片卷曲现象(图1,Q)，处理8 d卷曲更加严重而且还出现了部分叶片萎蔫干枯的症状(图1,S)，处理10 d时有部分叶片已经开始脱落(图1,T)。柑橘离体枝条叶片形态的变化表明，外源1.0 mmol·L-1H2O2能够有效缓解低温胁迫对柑橘离体枝条叶片的伤害。

2.2外源H2O2处理对低温胁迫下柑橘离体枝条叶片相对电导率和丙二醛含量的影响

在4 ℃低温胁迫处理下，对照及处理组柑橘离体枝条叶片的相对电导率(REC)均随处理时间而逐渐显著增加(表1)。其中，对照组柑橘离体枝条叶片的REC在处理2～10 d显著提高了4.46倍，表明叶片细胞膜受损伤程度随低温胁迫时间的延长也越来越严重。在T1处理组中，柑橘叶片REC在低温胁迫2～4 d与对照组无明显差异，在低温处理6 d时比对照组显著降低了23%，处理10 d时显著降低了28%，表明外源施加0.2mmol·L-1H2O2处理降低了低温胁迫导致的叶片REC上升。在T2组处理下，柑橘叶片的REC在低温胁迫4 d时比同期对照组显著降低了33.5%，处理10 d时则显著降低了48%，表明T2比T1处理能更有效缓解低温胁迫下柑橘叶片REC的升高趋势。与T2和T1处理组表现不同，T3组处理不仅没有缓解低温胁迫诱导的柑橘叶片REC上升趋势，反而使柑橘叶片REC上升更高，在处理2 d时已比同期对照升高了30.8%，处理10 d时上升幅度略有降低但仍比对照升高了9.9%，表明5.0 mmol·L-1H2O2处理没有缓解低温胁迫下柑橘叶片REC的升高，反而有加剧作用。同时，柑橘叶片中MDA含量的变化趋势与REC变化趋势基本相似，也是随低温胁迫时间的延长而显著升高，外源0.2和1.0 mmol·L-1H2O2处理均能有效缓解低温胁迫下柑橘叶片MDA含量的升高，且1.0 mmol·L-1H2O2处理效果更好；5.0 mmol·L-1H2O2处理反而促进了叶片MDA含量的进一步升高，加剧了低温胁迫伤害的程度。各处理组间数据比较显示，柑橘叶片中MDA含量与REC变化均从处理的第6天开始出现显著性差异。

CK、T1、T2、T3分别表示0、0.2、1.0、和5.0 mmol·L-1H2O2 处理；下同。

检测指标Detectionindex处理时间Treatmenttime2d4d6d8d10d相对电导率REC/%CK14.46±1.34eB36.90±1.59dB47.57±0.87cB53.77±1.95bB64.56±1.26aBT115.75±0.9cB32.27±3.44bB36.50±2.08bC44.09±1.55aC46.64±1.57aCT215.68±0.93dB24.53±2.44bC27.58±2.14bD30.18±1.96bD33.56±1.49aDT320.92±1.93eA40.17±2.22dA58.96±1.34cA63.25±1.84bA71.67±2.57aA丙二醛含量MDAcontent/(μmol·g-1)CK2.45±0.12dB4.56±0.25cA5.57±0.14bB5.40±0.19bB8.93±0.33aBT12.75±0.16dB3.61±0.12cB4.83±0.09bC4.76±0.46bC5.30±0.04aCT22.81±0.10bB3.20±0.44aB3.58±0.19aD3.52±0.23aD3.57±0.50aDT33.65±0.15dA4.50±0.30cA6.63±0.20bA6.79±0.34bA9.34±0.10aA

注：同行不同小写字母表示不同处理时期间在0.05水平存在显著性差异；同列不同大写字母表示同一处理时间对照组和不同浓度H2O2处理组间在0.05水平存在显著性差异。

Note:The different normal letters in the same row indicate significant difference among different treatment time at 0.05 level;The different capital letters in the same list indicate significant difference among treatments with different concentrations of H2O2at 0.05 level.

2.3外源H2O2处理对低温胁迫下柑橘离体枝条叶片H2O2积累的影响

DAB能够与H2O2反应生成红褐色物质，因此红褐色物质的出现反映了组织内H2O2的积累情况。图2可以看出，对照组柑橘叶片在4 ℃低温胁迫处理2 d时几乎没有明显的红褐色物质出现(图2，A)，在低温处理4 d时叶片的左下角冻伤区有明显的红褐色出现，反映出柑橘叶片的冻伤部位出现了明显的H2O2积累(图2，B)，在处理6 d时柑橘叶片左侧出现了大面积的H2O2积累(图2，C)，在低温处理8 d后柑橘叶片中的H2O2积累继续增高，叶片的大部分组织部位出现H2O2积累(图2，D)，当低温胁迫10 d时几乎全部柑橘叶片出现严重卷曲，H2O2积累更加严重(图2，E)。同时，T1组低温处理8和10 d时柑橘叶片均出现了H2O2积累(图2,I～G)，但其积累的程度明显比未对照组要轻；T2组柑橘叶片中的H2O2积累明显降低，甚至处理10 d时H2O2积累量仍然很低(图2,O)；T3组柑橘叶片中的H2O2积累没有明显的降低趋势，但与同期对照组相比H2O2积累较轻(图2,P～T)。以上结果表明，柑橘离体枝条叶片中H2O2积累水平随着低温胁迫时间的延长而逐渐上升，当外源施加0.2和1.0 mmol·L-1H2O2时其H2O2积累水平明显降低，并以1.0 mmol·L-1H2O2处理的降低效果最为显著。

2.4外源H2O2处理对低温胁迫下柑橘离体枝条叶片脯氨酸含量和抗氧化酶活性的影响

随低温胁迫时间的延长，CK组和T1、T2、T3处理组柑橘叶片的脯氨酸含量均呈逐渐升高趋势，且在处理10 d达到最大值(图3，A)。其中，对照组柑橘叶片的脯氨酸含量在4 ℃低温胁迫处理2～10 d期间提高了1.78倍；T1组柑橘叶片脯氨酸含量在处理6和10 d时分别比处理2 d相比升高1.62和2.26倍；T2组叶片的脯氨酸含量在处理6和10 d时分别比处理2 d时升高2.06和2.46倍，且在处理期间始终明显高于同期对照组，在低温处理10 d时几乎是同期对照组的2倍；T3组柑橘叶片中脯氨酸含量始终低于同期对照，且处理期间变化幅度不大。可见，各处理叶片脯氨酸含量均随低温胁迫处理时间延长而升高，外源1.0和0.2 mmol·L-1H2O2处理提高了脯氨酸含量的增幅，并以1.0 mmol·L-1H2O2处理的效果较好，而5.0 mmol·L-1H2O2处理则有降低脯氨酸含量的效应。

CK、T1、T2、T3分别表示0、0.2、1.0、和5.0 mmol·L-1H2O2 处理，

同时，各处理组柑橘叶片中SOD活性随低温处理时间均呈现先升高后降低的趋势，CK和T3处理组在处理的4 d后达到最大值，而T1和T2组则在处理6 d后达到最大值；在低温处理的6～10 d，各处理组柑橘叶片中SOD活性均以T2处理最高，T1处理其次，T3组和CK组最低(图3，B)。各处理组柑橘叶片中CAT酶活性也随处理时间呈先升高后降低的趋势，均在处理2 d后增速较快，至处理6 d时达到最大值；在处理2 d时，各处理及对照间无显著性差异，在处理4～10 d，柑橘叶片中CAT活性及其升幅表现为T2>T1>CK>T3(图3，C)。各处理柑橘叶片中POD活性变化趋势和SOD活性相似，整体也呈现先升高后降低趋势，且在处理后的6～10 d仍以T2组最高，T1组其次，CK组和T3组最低(图3，D)。以上结果说明1.0和0.2 mmol·L-1H2O2处理均明显提高了低温胁迫下柑橘叶片中SOD、CAT、POD活性，有效缓解低温胁迫引起的过氧化伤害，并以1.0 mmol·L-1H2O2处理效果更明显。

3讨论

叶片是柑橘进行光合作用和呼吸的主要器官，同时也是冻害最容易侵袭的部位，轻冻时可使柑橘叶片表皮细胞受害，叶片慢慢卷缩，光合作用减弱，重冻时则使柑橘叶片呈桶状卷曲，很快凋萎干枯，落叶严重，光合作用停止[1]。本研究结果显示‘日南1号’柑橘离体秋稍经4 ℃低温胁迫处理10 d后，其叶片由轻微卷曲到严重卷曲再到萎蔫干枯脱落，而外源施加0.2～1.0 mmol·L-1H2O2能够缓解了低温胁迫引起的柑橘叶片卷曲和萎蔫，提高柑橘的抗冻性。Ishibashia等[11]研究表明，向干旱胁迫8 d的大豆叶片喷施1.0 mmol·L-1H2O2可以延迟叶片萎蔫并提高叶片的相对含水量，本研究结果与之一致。

图3　H2O2处理对低温胁迫下柑橘离体枝条叶片脯氨酸含量和SOD,CAT,POD活性的影响

相对电导率(REC)和MDA含量均是植物遭受低温胁迫后细胞膜透性变化的重要生理指标，能有效反映细胞膜系统遭受低温伤害的程度，且大多数植物在低温胁迫下REC和MDA含量升高[12-13]。本实验结果表明，柑橘叶片的REC经4 ℃低温胁迫处理10 d后显著升高，其细胞膜受损伤程度随低温胁迫时间的延长也愈加严重，施加0.2～1.0 mmol·L-1H2O2处理10 d后有效缓解低温胁迫造成的柑橘叶片REC大幅升高的趋势，但浓度超过5.0 mmol·L-1时作用不明显甚至后期加重低温胁迫造成的伤害。研究表明，先后通过向4 ℃低温处理36 h的绿豆叶片喷施200 mmol·L-1H2O2，绿豆幼苗的存活率由30%提高到70%，相对电导率由86%降低到21%[6,14-15]，本实验结果虽然与之相似，但施用的H2O2浓度却相差很大，这可能与处理的植物、处理时间和取材差异有关。同时，本研究中柑橘叶片中MDA含量的变化趋势与REC变化趋势基本相似，也是随低温时间的延长而显著升高，1.0 mmol·L-1H2O2处理能缓解低温胁迫下柑橘叶片MDA含量的升高。李金亭等[16]研究结果也表明0.05 μmol·L-1H2O2处理降低了150 mmol·L-1NaCl盐胁迫处理引起的MDA含量升高。另外，本研究中H2O2的DAB组织化学定位结果表明，随着低温胁迫时间的延长，柑橘叶片中H2O2积累水平逐渐上升，1.0 mmol·L-1H2O2处理对低温胁迫柑橘叶片中H2O2积累的降低效果最为显著，这一结果进一步证实了各剂量外源H2O2处理对低温胁迫下柑橘叶片细胞膜受损害的缓解效应。

脯氨酸为渗透调节物质[17]，而SOD、CAT和POD均是植物细胞内清除活性氧和维持植物体内活性氧的重要酶[18]，它们对维持细胞膜的完整性及提高植物的抗逆性具有重要的意义。本研究结果表明，外源施加合适浓度的H2O2处理可以提高低温胁迫下柑橘叶片的渗透调节能力，增强了柑橘叶片中的SOD、CAT和POD等抗氧化酶的活性，增强了ROS清除能力，但随H2O2处理浓度增至5.0 mmol·L-1时超出了抗氧化系统自我调节的范围，抗氧化系统活性又表现出了明显的下降趋势。Neto等[19]向水培玉米根中施加1 umol·L-1H2O2进行预处理，发现H2O2减轻了NaCl胁迫对盐胁迫敏感型玉米的伤害，提高了SOD、 CAT和POD的活性，从而使盐敏感型玉米获得了更高的盐耐受能力。吴国荣等研究证实适宜浓度H2O2预处理盐泽螺旋藻诱导提高了其SOD、CAT和POD的活性，有效地抑制了藻细胞内活性氧的积累[20]，这与本研究中1.0和0.2 mmol·L-1H2O2处理组柑橘叶片中SOD、CAT和POD活性表现一致。

综上所述，4 ℃低温处理能够引起柑橘离体秋梢叶片卷曲、枯萎、脱落等受害症状，外源喷施1.0 mmol·L-1H2O2可以提高低温胁迫下柑橘叶片的脯氨酸含量与SOD、 CAT和POD抗氧化酶活性，有效缓解低温对柑橘叶片细胞膜的伤害，从而增强其耐寒性。该研究为后期开发含H2O2的抗冻剂和柑橘冻害的防控提供了重要依据。

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(编辑:裴阿卫)

Effect of Exogenous H2O2Treatment on Cold Resistance ofCitrusreticulataLeaves under Low Temperature Stress

JIANG Jinglong

(School of Biological Science and Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong,Shaanxi 723001,China)

Abstract:Fall shoot of Citrus(Citrus reticulata Blanco.‘Nichinan No.1’) cultured in hoagland hydroponic solution were used as experimental materials to study effects of different concentration of H2O2 treatments on growing state and physiological indexes of relative electric conductivity(REC),contents of malondialdehyde (MDA) and proline as well as activities of catalase(CAT),superoxide dismutase(SOD) and peroxidase(POD) in C.reticulata leaves under 4 ℃ low temperature stress.Meantime optimum H2O2 concentration was selected to alleviate chilling injury of C.reticulata and the mechanism of tolerance to cold in C.reticulata with exogenous H2O2 treated was also explored.Results showed that the degree of curl and cell membrane damage of leaf gradually increased with the extension of low temperature stress time in all treated groups of C.reticulata.Both 0.2 mmol·L(-1 )and 1.0 mmol·L(-1)concentrations of H2O(2 )applied to hydroponic solution could ease C.reticulata leaves curling and wilting caused by low temperature stress,lower the increase of REC and MDA,reduce the accumulation of H2O2,and increase the content of osmotic proline and activities of SOD,CAT and POD in C.reticulata leaves.The 1.0 mmol·L(-1) of H2O(2 )alleviated chilling stress on C.reticulata damage more significant than that of the concentration of 0.2 mmol·L(-1).The studies confirmed that the symptoms of leaf curl,wither,fall off and cell membrane damage were caused by treatment of 4 ℃ low temperature in autumn shoots leaves of C.reticulata.And the treatment of 1.0 mmol·L(-1)H2O2could increase the content of proline and activities of SOD,CAT and POD under low temperature stress,and effectively relieve the damage of cell membrane under low temperature in C.reticulata leaves,to enhance its cold resistance.

Key words:Citrus reticulata;low temperature stress;exogenous hydrogen peroxide;cold resistance

中图分类号：Q945.78

文献标志码：A

作者简介：蒋景龙(1980-)，男，博士，讲师，硕士生导师，主要从事逆境植物学方面的研究。E-mail：jiangjinglong511@163.com

基金项目：陕西省科技厅自然科学基础研究计划(2014JQ3113)；陕西省教育厅自然科学研究项目(14JK1158)；陕西理工学院科研基金(SLGKY15-41)；陕西理工学院研究生创新基金(SLGYCX1517)。

收稿日期：2015-12-14；修改稿收到日期：2016-03-09

文章编号:1000-4025(2016)03-0499-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0499