商洛野生蕨菜多糖提取及其抗氧化特性研究

华智锐,李小玲

(商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000)

商洛野生蕨菜多糖提取及其抗氧化特性研究

华智锐,李小玲

(商洛学院 生物医药与食品工程学院,陕西 商洛 726000)

以商洛野生蕨菜为实验材料，通过单因素实验和正交实验研究了用碱提法提取多糖的最佳条件，比较了3种方法提取多糖的效果，并测定了蕨菜多糖的抗氧化性。研究结果表明：碱提法的最优条件为温度75 ℃、时间80 min、料液比1∶13、氢氧化钠浓度0.4 mol/L；水提法、碱提法和超声波提取法的多糖提取率分别为7.37%、20.436%和25.694%;商洛野生蕨菜多糖对超氧阴离子和羟基自由基的清除能力随着其浓度的升高而增强。

商洛；野生蕨菜;多糖;提取;抗氧化特性

蕨菜(Pteridiumaquilinum)属于蕨类植物门蕨纲凤尾蕨科的多年生草本植物,别名拳芽、拳头菜、如意菜等,生长于阳光充足的山坡或湿度较高的丛林茂密地区。蕨菜广泛分布于全球亚热带、暖温带和温带地区,在我国分布极其广泛,东北、华北、西北地区都有分布,且产量较高,是我国传统的大宗森林野生蔬菜之一,有“山菜之王”之美誉[1]。

蕨菜有很高的营养价值,含有多种维生素、氨基酸、蛋白质以及对人体有重要作用的微量元素。除此之外,蕨菜还有药用价值,其全草入药,具有清热利湿、消肿、安神的功效[2]。将蕨菜制成茶饮品,其还具有止呕、杀菌、滋补、开胃等作用[3-5]。蕨菜的食用部分为其幼嫩茎,其多糖含量丰富,具有多种积极作用。多糖可作为免疫调节剂激活巨噬细胞、T淋巴细胞、LAK细胞等多种免疫细胞,促进生产细胞因子,活化补体,而且具有抗肿瘤、抗感染、抗氧化、抗消化性溃疡、降血糖血脂等作用[6-7]。

近年来国内学者对多糖的研究较多,例如：周林珠等[8]综述了多糖抗氧化性进展；李粉玲等[9]研究了红豆多糖抗氧化性；孟思彤等[10]研究了多糖的生物活性。商洛地处秦岭南脉,处于北亚热带与暖温带交接地区,气候温和,雨量充沛,因得天独厚的自然环境和气候条件而盛产蕨菜[11]。商洛蕨菜“商芝”是地方传统名菜,历史悠久。但迄今有关蕨菜资源开发利用方面的研究甚少,仅张云等[11]研究了商洛野生蕨菜资源的产业化开发；朱小强等[12]研究了商洛蕨菜的采收与加工；李彬[13]研究了蕨菜的护色工艺。笔者通过比较蕨菜多糖的不同提取方法,筛选出商洛蕨菜多糖的最佳提取方法,并进一步研究了其多糖浓度与抗氧化特性的关系,旨在为今后合理开发商洛蕨菜的食用和药用价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试蕨菜于4月14日早上采于商洛市商州区红升村。将新鲜蕨菜用保鲜膜小心包好,装入纸箱中快速运回实验室,经过生物学院中心实验室鉴定为蕨类植物门蕨纲真蕨目凤尾蕨科蕨菜种。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的制作 称取0.1175 g葡萄糖,用蒸馏水溶解，定容到1000 mL,即配制成0.1175 g/L的葡萄糖标准液。取6支试管(编号为1～6号),分别加葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL,蒸馏水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8 mL,6%苯酚溶液各1.0 mL，浓硫酸各5.0 mL，配制成6个浓度。摇匀后静置20 min,在490 nm处测量各试管中溶液的吸光度值(A490),再根据葡萄糖浓度和吸光度值(A490)做出葡萄糖标准曲线。

1.2.2 材料预处理 将采集回来的新鲜蕨菜去除木质化老茎,取其顶芽以下15 cm部分,清洗干净,使其自然晾干。切成5 cm左右的小段,于干燥箱中70 ℃过夜烘干以去除细胞内自由水。用万能粉碎机打成粉末,过40目筛后置于干燥箱中105 ℃烘制4 h,以除去细胞内的结合水。置于干燥环境保存备用。

1.2.3 用水提法提取商洛野生蕨菜多糖 称取5 g蕨菜干粉置于250 mL烧杯中,加入94 mL蒸馏水,于水浴锅中62.5 ℃水浴5.9 h。将提取液离心2次,转速为4000 r/min,时间10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL定容至20 mL,取2 mL，加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL浓硫酸,摇匀后静置30 min后在490 nm处测量吸光度。根据吸光度得到多糖浓度,再利用以下公式求出提取率：提取率(%)=[(C×V×N)/M样],其中C为供试品溶液的多糖浓度,V为多糖提取液体积,N为稀释倍数,M样为蕨菜粉末的质量。

1.2.4 通过单因素实验和正交实验优化碱提法

1.2.4.1 NaOH浓度对碱提法提取率的影响 取5支试管,编号1～5,分别加入浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的NaOH溶液7 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,在40 ℃水浴锅中保温1 h。将各试管提取液离心2次,转速为4000 r/min,时间为10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL定容至20 mL,再取1.0 mL，加5 mL相应浓度的NaOH，摇匀。取2 mL稀释液，加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL浓硫酸,摇匀后静置30 min,然后在490 nm处测量吸光度。根据1.2.3中的提取率公式算出提取率。

1.2.4.2 料液比对碱提法提取率的影响 取5支试管,编号6～10,分别加入浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,在40 ℃水浴锅中保温1 h。将提取液离心2次,转速为4000 r/min,时间为10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL,定容至20 mL,再取1.0 mL,加5 mL相应浓度的NaOH,摇匀。取2 mL稀释液,加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL浓硫酸,摇匀后静置30 min,然后在490 nm处测量吸光度。根据1.2.3中的提取率公式算出提取率。

1.2.4.3 保温时间对碱提法提取率的影响 取5支试管,编号10～15,均加入浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠溶液7.0 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,在40 ℃水浴锅中分别保温0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,将各试管提取液离心2次,转速为4000 r/min,时间为10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL，定容至20 mL,再取1.0 mL，加5 mL相应浓度的NaOH，摇匀。取2 mL稀释液，加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL浓硫酸,摇匀后静置30 min，然后在490 nm处测量吸光度。根据1.2.3中的提取率公式算出提取率。

1.2.4.4 温度对碱提法提取率的影响 取5支试管,编号16～20,均加入浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠溶液7.0 mL,加入蕨菜粉末0.5 g,分别在40、50、60、70、80 ℃水浴锅中保温 1 h, 将各试管提取液离心2次,转速为4000 r/min,时间为10 min,保留上清液。吸取上清液1 mL,定容至20 mL,再取1.0 mL,加5 mL相应浓度的NaOH,摇匀。取2 mL稀释液,加入1.0 mL 6%的苯酚和5.0 mL浓硫酸,摇匀后静置30 min,然后在490 nm处测量吸光度。

根据以上单因素实验结果,选取各个因素的最佳水平附近的3个水平进行正交实验。因素与水平设计见表2。设计的正交实验表如表3。对9组试管中的提取液均以4000 r/min离心10 min，共离心2次。保留上清液,在490 nm处测量吸光度。根据吸光度得到多糖浓度,再利用1.2.3中的公式求出提取率。最后根据正交实验所获得的最优条件结果进行实验，并求出提取率。

1.2.5 用超声波法提取商洛野生蕨菜多糖 称取2.5 g蕨菜干粉于烧杯中,加入75 mL蒸馏水,在超声波清洗器中以功率100 W、温度75 ℃超声提取70 min；对提取液离心2次,4000 r/min,10 min。保留上清液。在490 nm处测量吸光度。根据吸光度得到多糖浓度,再计算出提取率。

1.2.6 用硫酸-苯酚法测定商洛野生蕨菜多糖含量 常用的多糖测定方法有硫酸-蒽酮法和硫酸-苯酚法,两种方法的原理大致相同,都是利用浓硫酸将多糖水解成单糖后,迅速脱水生成糠醛衍生物,其中蒽酮与单糖生成蓝绿色糠醛衍生物,而苯酚与其反应可生成黄色化合物[14]。这两种方法相比较,苯酚-硫酸法操作步骤简单，反应后较稳定，所使用的仪器也简单,所以应用范围较广[15-17]。

将以上3种方法得到的各组提取液稀释后各取2 mL，加入6%的苯酚1 mL和5 mL浓硫酸,摇匀后静置30 min,在490 nm下测量吸光度值。分别算出各组的供试多糖的浓度和提取率。

1.2.7 商洛野生蕨菜多糖抗氧化特性的研究 将提取到的多糖进行梯度稀释,取5支试管,分别加提取液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,蒸馏水0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，则5支试管中的多糖浓度分别为0.214、0.0428、0.0642、0.0859、0.10706 g/L。吸取各试管中的稀释液各1.0 mL，测定吸光度,再根据吸光度求出清除率。

1.2.7.1 多糖对超氧阴离子的清除能力测定 取1.2.7中5组提取液各0.1 mL,分别加入Tris-HCl 3 mL,在25 ℃水浴锅中保温20 min后加入邻苯三酚3.0 mL,待其反应5 min后再加入0.5 mL HCl,摇匀后以蒸馏水作对照,在420 nm处测量吸光度值。根据以下公式求出清除率：清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%,式中A0为邻苯三酚自养化平均吸光度,A1为加入样品后的吸光度。

1.2.7.2 多糖对羟基自由基的清除能力测定 取1.2.7中5组提取液各1 mL,分别加入1 mL硫酸亚铁、1 mL水杨酸-乙醇溶液,再加入1 mL过氧化氢溶液,在37 ℃水浴锅中水浴30 min。以蒸馏水作对照,在510 nm处测量吸光度值。利用公式:清除率(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%算出商洛野生蕨菜多糖的清除率。式中A0为对照组吸光度,Ax为各组稀释液的吸光度值,Ax0为不加过氧化氢的吸光度。

1.2.8 数据处理方法 采用Excel对实验数据进行处理、作图分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

根据葡萄糖标准溶液的浓度梯度测定的吸光度见表1。最终绘制的标准曲线见图1。以葡萄糖浓度(g/L)为横坐标x,吸光度值(A490)为纵坐标y,采用最小二乘法进行线性回归,得到的线性回归方程为y=4.5050x+0.0474。

表1 葡萄糖溶液的浓度梯度及其吸光度测定结果

图1 葡萄糖的标准曲线

2.2 水提法的多糖提取率

测得水提法提取液的吸光度值(A490)为0.1357。将其代入2.1中的线性回归方程,得到水提法提取的商洛野生蕨菜的多糖浓度为0.0196 g/L。根据1.2.3中的提取率公式求出提取率为7.37%。

2.3 碱提法的最优条件和提取率

2.3.1 氢氧化钠浓度 由图2可以看出,吸光度随着氢氧化钠浓度的升高呈现先升后降的趋势,当氢氧化钠浓度为0.4 mol/L时吸光度值最大。随后,随着氢氧化钠浓度的增加,吸光度值逐渐下降。因此可以确定氢氧化钠浓度0.4 mol/L为最佳提取浓度。

图2 氢氧化钠浓度对吸光度的影响

2.3.2 料液比 由图3可知,吸光度随着料液比的升高呈现先升后降再升高的趋势,当料液比为1∶12时吸光度最大,因此可以选择料液比1∶12作为最佳条件。

2.3.3 时间 由图4可以看出,吸光度随时间延长呈现先升后降的趋势，当时间为1 h时,吸光度达到最大值,因此可以确定时间1 h为最佳条件。

2.3.4 温度 由图5可以看出,吸光度随着温度的增加呈现先升后降的趋势,当温度为70 ℃时有最大吸光度值,因此可以选择70 ℃为最佳温度条件。

图3 料液比对吸光度的影响

图4 时间对吸光度的影响

2.3.4 温度 由图5可以看出,吸光度随着温度的增加呈现先升后降的趋势,当温度为70 ℃时有最大吸光度值,因此可以选择70 ℃为最佳温度条件。

图5 温度对吸光度的影响

2.3.5 正交实验结果 根据上述的4组单因素实验结果,对氢氧化钠浓度(A)、料液比(B)、时间(C)和温度(D)4个因素进行正交试验。参考单因素的最佳条件并考虑到实验效率和节约材料,将上述4个因素各设置3个水平(见表2)，制定L934正交实验表(表3)。

表2 正交实验因素的水平设置

从表3可以看出，因素A、B、C、D的极差R值分别为1.332、3.336、4.460、6.628,因此可以得出这4个因素对蕨菜多糖提取的影响顺序为:温度>时间>料液比>氢氧化钠浓度。比较各因素的K1～K3值可知，各因素的最优水平分别为A2、B3、C3、D3，因此这4个因素的最优组合为D3C3B3A2，即蕨菜多糖提取的最优条件组合为：温度75 ℃、时间80 min、料液比1∶13、氢氧化钠浓度0.4 mol/L。在这种最优条件下吸光度为0.484,按提取率公式算得提取到的商洛野生蕨菜多糖浓度为0.0969 g/L,提取率为20.436%。

2.4 超声波提取法的多糖提取率

测得超声波提取液的吸光度值(A490)为0.5297。代入图1回归方程,可知提取到的多糖浓度为0.10706 g/L。根据1.2.3中的公式算得多糖提取率为25.694%。

2.5 多糖的抗氧化性

2.5.1 清除超氧阴离子的能力 各试管提取液的吸光度值(A490)见表4,利用1.2.7.1中的清除率公式算出各组多糖的提取率。以多糖浓度(mg/mL)为横坐标,以多糖提取率(%)为纵坐标,用Excel作图见图6。

2.5.2 清除羟基自由基的能力 各试管提取液的吸光度值(A510)见表5。以多糖浓度(mg/mL)为横坐标,以多糖提取率(%)为纵坐标,用Excel作图见图6。

由图6可知,商洛野生蕨菜多糖对超氧阴离子和羟基自由基的清除率随着其浓度的增加而增加,当多糖浓度为0.0856 mg/mL时,其对超氧阴离子的清除率为71.78%,此后其抗氧化能力增加的幅度减缓。当多糖浓度为0.0642 mg/mL时,其对羟基自由基的清除率为71.73%,此后增长幅度减弱。 图6中两条曲线交点处的多糖浓度为0.0627 mg/mL，在此之前,商洛野生蕨菜多糖对超氧阴离子的清除率大于对羟基自由基的清除率；在此之后,其对羟基自由基的清除率大于对超氧阴离子的清除率。

3 结论与讨论

水提法是植物多糖提取方法中较为传统的一种,此方法操作容易,成本较低,设备简单,但不足的是,提取时间较长,所需温度较高,而且还会引起多糖降解；此外,材料的粒度、料液比、不同部位等因素也会影响最终的提取率。黄劲松等[18]、许文涛等[19]研究了蕨菜多糖提取工艺,优化了水提法的提取条件,得出最佳温度为62.5 ℃，最佳料液比为1∶18.8，最佳提取时间为5.9 h,最终其提取率为6.06%。笔者参照上述最优条件提取2次,实际提取率为7.37%,其中的差异可能与蕨菜的生长条件和幼嫩程度有关。

表3 碱提法单因素优化正交设计及实验结果分析

表4 多糖对超氧阴离子的清除率

表5 多糖对羟基自由基的清除率

图6 不同浓度多糖对超氧阴离子

薛丹等[20]综述了近年来国内外对植物多糖提取分离纯化的研究,其中指出碱水提取法可用于酸性多糖和含有糖醛酸的多糖的提取分离。碱提法的常用溶液有NaOH、KOH、Ca(OH)2等,碱的浓度不宜太高,否则会破坏多糖的结构,进而影响多糖的提取率。关于用碱提法提取蕨菜多糖的研究不多,因此本实验对碱提法的条件进行了优化。向东等[21]研究得出碱提法提取南瓜多糖的最优条件为:提取温度80 ℃、提取时间2 h、料液比1∶5、氢氧化钠浓度0.4 mol/L。杨云等[22]优化了碱提法提取大枣渣多糖的条件:温度为80 ℃,时间为3 h,Na2CO3浓度为0.5 mol/L。本实验综合各种研究,设计了预实验及正交试验，最终得出的最优条件为:温度75 ℃、时间80 min、料液比1 g∶13 mL、氢氧化钠浓度0.4 mol/L。在此最优组合条件下，多糖提取率为20.436%。如果料液比过小则不利于蕨菜粉末与碱溶液的充分反应,若过大则不利于多糖结构的稳定。当氢氧化钠浓度过高时,会破坏多糖的结构,进而影响吸光度值。

超声波提取法利用超声波的空化效应、机械效应和热效应对植物组织产生很大的压力,使细胞壁及生物组织瞬间破裂,破碎时间大大缩短。超声波产生的震动作用和较强的穿透力还会促进胞内物质的释放和扩散,从而提高提取率[23]。然而,超声波提取法会受到料液比、功率、时间和温度等不同因素的影响。张芝维等[24]研究了用超声波法提取野生蕨菜多糖，并对该方法进行了优化,最终得出的最优参数为:料液比1∶30、超声功率100 W、时间70 min、温度75 ℃。本实验参考上述条件,最终超声波法的多糖提取率为25.694%。与上述研究结果基本相同。

在本研究中采用的水提法、碱提法和超声波提取法的多糖浓度分别为0.01967、0.0969、0.10706 mg/mL，提取率分别为7.37%、20.436%和25.694%；无论是多糖浓度还是提取率,超声波法都得到了最大值,碱提法次之,浸泡法最小。所以可以确定商洛野生蕨菜多糖的最佳提取方法为超声波法。

本文对蕨菜多糖的抗氧化特性研究表明,随着多糖浓度的增加,多糖清除超氧阴离子和羟基自由基的能力增加。该结果与陈玉琴等[25]的研究结果大致相同。本实验用邻苯三酚自氧化反应研究多糖对超氧阴离子的清除能力。在碱性(pH=8.2)条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,产生超氧阴离子和有色的中间产物,该产物在波长420 nm处有一特征吸收峰,当加入清除剂时,超氧阴离子的生成受阻,溶液在420 nm处的吸光度值减少。通过测定A420可以算出多糖对超氧阴离子的清除作用[26-27]。研究结果(图6)显示：当多糖浓度为0.0856 mg/mL时,其对超氧阴离子的清除率为71.78%,此后的清除能力增加缓慢。

在本研究中,用Fenton反应测定多糖对羟基自由基的清除能力。过氧化氢与Fe2+反应后产生OH-,其反应活性很高,且存在时间短；在反应体系中加入的水杨酸会捕捉OH-并产生有色物质,该物质在波长510 nm处有特征吸收峰,如果加入能清除OH-的物质,就会与水杨酸竞争OH-,从而使有色物质减少,吸光度值降低，这样即能测定多糖对羟基自由基的清除能力[28-29]。今后有关商洛野生蕨菜多糖的提取方法及多糖的抗氧化特性都还有待深入研究；结合商洛蕨菜富含的真实多糖浓度积极开展相关抗氧化特性研究,能为人类合理食用蕨菜,从而发挥其多糖的最佳功效提供参考。

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Study on Extraction Technology and Antioxidant Activity of Polysaccharide fromPteridiumaquilinumin Shangluo

HUA Zhi-rui, LI Xiao-ling

(College of Biology Pharmacy and Food Engineering, Shangluo University, Shangluo 726000, China)

Taking Shangluo bracken (Pteridiumaquilinum) as the material, the best method of polysaccharide extraction and the determination of antioxidant concentration of polysaccharide were studied through the single factor experiment and orthogonal experiment, The effect of the three methods to extract polysaccharide was compared, and the oxidation resistance of bracken polysaccharide was measured. The results showed that the optimum extraction procedure was as following: the temperature was 75 ℃, the time was 80 min, the ratio of material to liquor was 1∶13, the contention of NaOH was 0.4 mol/L. The extraction rate of water, alkali and ultrasonic was 7.37%, 20.436% ,and 25.694% , respectively. The removal ability to O2-and OH-of polysaccharide increased with the increasing of polysaccharide concentration.

Shangluo city;Pteridiumaquilinum; Polysaccharide; Extraction; Antioxidant activity

2015-09-03

陕西省科技厅项目(2011K01-18)。

华智锐(1980─),男,湖北黄石人,讲师,硕士,主要从事园艺生物技术研究。

Q914.85

A

1001-8581(2016)03-0047-06

黄荣华)