水曲柳复幼——微繁技术研究*

薛文辉　詹亚光　何利明　朱　珠　于　磊

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江　哈尔滨　150040）



水曲柳复幼——微繁技术研究*

薛文辉詹亚光**何利明朱珠于磊

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040）

摘要：采用截干、喷施激素、掩埋锯末三种处理方式对水曲柳2年生幼苗进行复幼处理，并以萌生枝条的顶芽及腋芽作为外植体，探讨最佳复幼——微繁体系，结果表明：（1）截干+喷施激素处理的幼苗产生的穗条数量、长度及直径均优于其它处理，每株幼苗当年可产出6～7条可供嫁接的穗条和20个左右茎节外植体（水曲柳对照平均为4～5个）。（2）复幼处理获得的萌条茎节进行组织培养时，新芽启动率和增殖系数均超出对照，其中截干+喷施BA组合最为突出，启动率超出对照的132%，而截干+喷施激素+掩埋锯末初代增殖系数最高，超出对照65.2%。（3）经隶属函数评分排序，选出附加ZT 1.0 mg/L和2%蔗糖的WPM培养基最有利于新芽分化，增殖系数达到9.61，与其它处理差异显著。

关键词：水曲柳；促萌；复幼；微繁

*国家科技支撑项目（2012BAD01B0503）和国家自然科学基金课题（31270697）资助

水曲柳（Fraxinus mandshurica）为木犀科白蜡属落叶乔木，我国二级重点保护野生植物。水曲柳在我国北方地区分布广泛，既是我国东北重要的低温森林生态系统优质用材树种[1-2]，也是优良的绿色观赏树种和药用植物。传统的水曲柳繁殖是以种子繁殖为主，但其种子具有深休眠特性[3-4],给育苗生产带来了一定的困难。水曲柳的嫁接和扦插等繁殖技术受到穗条数量少、位置效应[5-6]和采枝母树的年龄效应[7]的影响，限制了规模化应用[8-9]。鉴于组织培养方法具有促进植株繁殖速度[10]、保持其优良性状的特点，本试验通过对水曲柳进行复幼处理，既成功获得大量幼嫩穗条，解决了生产中穗条或插条来源少的问题，同时，其带有顶芽或腋芽的茎节又可以作为组织培养的材料，解决了水曲柳组织培养主要依赖合子胚，以及诱导体细胞胚发生效率低的问题[11-13]，现将有关研究结果报道如下。

1　试验材料与方法

1.1试验材料

试验材料为黑龙江省伊春市带岭区国家种子园栽培的2年生水曲柳实生苗。

1.2试验方法

1.2.1水曲柳幼苗的复幼处理

为筛选出最佳复幼处理方式，本试验于2014年4月10日将收集的实生苗定植于塑料花盆中，适应生长至5月1日，采用截干（地上部分留取10cm）、基部掩埋锯末、喷施外源激素3种不同组合方式进行复幼处理，并以未采取任何处理的幼苗为对照（表1），每种处理8株幼苗，3次重复。

表1　实生苗的复幼处理方式

6月10日对截干处理方式的苗木进行第一次截干处理，并采集穗条，统计穗条数量、长度、直径、茎节外植体数。之后，又分别于7月30日和9月10日进行两次截干处理，采集所有穗条，统计相关数据。此后，因天气原因，幼苗不再产生穗条。故本次试验一年之内共采集3次穗条。

对于未进行截干处理的4种处理方式的幼苗于同一时间分别统计其当年生长枝条的生长量、直径及其茎节外植体数。

1.2.2不同茎节外植体的初代培养

以萌条上带顶芽或腋芽的茎节作为外植体，在接种前用流动水冲洗30min，无菌水冲洗3～4遍，再用75%酒精浸泡30 s，边泡边摇，然后用0.1%升汞灭菌2 min，用无菌水冲洗3～4遍。之后，将不同处理方式获得的外植体随机分为3组，分别接种到含BA 1.0 mg/L的WPM培养基中进行初代培养，促进启动萌发，并统计不同处理的启动率与增殖系数。

1.2.3不同激素组合的分化培养

本研究通过实证问卷调查，证实了经济状况在社会隔离与生存质量之间的调节作用，并基于社会资本理论视角，探讨了三者关系的作用机制，以期为改善农村居民社会隔离现状提供理论参考，并为提高农村居民生存质量贡献切实策略。农村居民的社会隔离是社会变迁带来的客观结局，将极大地威胁到农村居民的生存质量。政府应当给予农村居民适当的政策关怀，丰富农村社交娱乐活动，鼓励农村居民积极参与，增进人际互动关系，避免陷入社会隔离。此外，针对贫困地区居民应采取有效的帮扶政策，尽量避免农村居民承担过重的经济负荷，坚持共享改革发展成果，呵护农村居民的身心健康，着力增进农村居民福祉，进而早日实现人人健康，全面小康的总目标。

在经过一次继代培养之后，组培苗出现不同程度的老化或休眠状态，为此，本试验将第一次继代培养的组培苗平均分组继代到4种含有不同激素组合的WPM培养基（表2）中，培养1个月后，统计各组培苗基部萌生芽数、芽生长量、萌生芽节间数、增殖系数。

为了综合评价不同分化培养基中组培苗的分化效果，采用隶属函数法，利用萌生芽数、芽生长量、萌生芽节间数、增殖系数4个指标的隶属函数值对茎节萌生组培苗的分化能力进行了比较，以筛选出有利于组培苗分化的最佳培养基。隶属函数计算公式为[14]

式中，Xij为i种培养基中组培苗j指标的测定值；Ximin为所有培养基中组培苗j指标测定值的最小值；Ximax为所有培养基中组培苗j指标测定值的最大值；为i培养基中组培苗j指标的隶属函数值。

将各培养基所有指标的隶属函数值进行累加，求其平均数得各培养基的隶属函数值值大表示分化系数大，易于组培苗分化。

表2　3种培养基的激素组合

1.2.4数据统计

试验数据采用IBMSPSS Statistics19.0进行方差分析，Dun-can检测方法，0.05检测水平。

2　结果与分析

2.1复幼处理对萌生枝条质量的影响

表3　不同时期各处理方式穗条质量

由各处理平均每株幼苗1年获得的带顶芽或腋芽的茎节外植体数（图1）可以看出，4号处理（截干+喷施BA）与7号处理（仅截干）获得的茎节外植体数显著高于其它处理，其中4号处理获得的茎节外植体数最高，平均值为20.22个，而对照仅为4.75个。

图1　不同处理每株幼苗年产外植体数

试验过程中，由于未经截干处理的水曲柳只有当年生长量而未萌生幼嫩穗条，而且用其当年生长枝条的茎节进行组织培养时不仅难以启动，且较易染菌，故后继的组培试验中仅选取了经过截干处理的幼苗及对照组。

2.2不同茎节外植体的初代培养

2.2.1不同处理茎节外植体的启动率

由接种到含BA 1.0 mg/L的WPM培养基中外植体所获得的茎节萌发启动率（图2）可知：对照组的启动率仅为36%，而处理1、4、5、7的启动率分别为77%、80%、80%、78%，分别超过对照组115%、132%、132%、117%。这说明，水曲柳经复幼处理后，以其茎节外植体作为组织培养的材料，其萌发启动效果要远远优于对照。

图2　不同处理方式的外植体启动率

2.2.2不同处理茎节外植体的初代培养效果

由不同茎节外植体初代培养时基部萌生芽数及增殖系数（图3）可知，复幼处理的茎节外植体基部萌生芽数及增殖系数均高于对照，其中基部萌生芽数差异不显著；1号处理（截干+喷施BA+掩埋锯末）基部萌芽数最多，平均值为1.45个；对照组为1.22个。初代培养增殖系数差异显著，1号处理增殖系数最高，为2.18；对照组为1.32。

图3　不同处理方式茎节外植体初代培养效果

2.3不同激素组合的分化培养效果

由分化培养的基部萌生芽数、芽生长量、萌生芽节间数、增殖系数（图4）可以看出，各试验组合均有不同程度的组培苗分化，萌生芽数和生长量在4种培养基之间差异不显著；4号培养基节间数显著高于其它三种培养基；4号培养基增殖系数最高，为9.61，而3号培养基增殖系数最低，为6.67。说明在ZT浓度为1.0 mg/L的WPM培养基中培养茎节外植体有利于诱导组培苗的分化。

图4　不同激素组合培养基的组培苗分化情况

利用萌生芽数、生长量、节间数、增殖系数4个指标的隶属函数值对茎段萌生组培苗的分化能力进行综合性评价的结果（表4）表明，组培苗分化能力最强的是4号培养基，其次为1号培养基，而3号培养基分化能力最弱。由此可以进一步说明，在ZT浓度为1.0 mg/L的WPM培养基中培养茎段外植体有利于诱导组培苗的分化。

表4　不同激素组合培养基组培苗分化能力综合评价

3　讨　论

3.1以茎节作为外植体进行组织培养受到穗条生长状态的影响，越是幼嫩的穗条越有利于水曲柳的无性繁殖。本试验通过复幼处理获得了较对照组呈幼化状态的穗条，这种穗条有利于扦插或嫁接。同时，由穗条获得的茎节外植体不仅利于组织培养过程中的脱菌及萌芽处理，而且具有超出对照组1倍以上的启动率，组培苗增殖系数显著高于对照组。说明复幼处理不仅有利于维持穗条及外植体的幼化状态，而且有利于水曲柳的微体繁殖。另外，为了解决以水曲柳穗条茎节作为外植体进行组织培养易出现老化现象[15]，本研究对培养条件进行了优化。

3.2对水曲柳实生苗进行复幼处理获得的穗条具有较母树更好的幼化效果，这与刘东玉[16]等对滇杨的研究结果一致。翁海龙[17]等利用建立采穗圃进行嫁接的方法获得了良好的落叶松继代嫁接幼化效果。毛竹[18]、玉米[19]等的相关研究表明，植株的成熟效应与基因组相关基因的甲基化状态相关，可以进一步测定基因甲基化状态来验证复幼处理的幼化效果。

3.3微体繁殖是一种能够保持优良品种遗传性状的快速繁殖方法，在微体繁殖过程中，各种植物生长调节剂能够影响组培苗的生长量和分化状态等指标[18]。本试验在前期工作的基础上采用4种不同激素组合的培养基进行了组培苗的分化培养，并筛选出较利于组培苗分化的培养基。

参考文献

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（责任编辑：王岳）

Rejuvenation and Micropropagation Study in Fraxinus mandschurica

XUE Wenhui
（College of Life Science,Northeast Forestry University,Heilongjiang Harbin 150040）

Abstract 2 years old seedlings of Fraxinus mandschurica were treated by cutting,spraying hormones and covering with sawdust.In order to explore the influence of different treatments on the seedlings,the apical and lateral buds that germinated from the treated shoots were cultured in the same medium.And then the culture condition of tissue culture seedlings was optimized by using the same medium with different hormones combinations.The results showed that:(1) the number,length and diameter of coppice shoot that came from young seedlings and treated by cutting and hormones,were better than other treatments.Under this treatment,one seedling could produce six to seven coppice shoots for grafting or about twenty stems for tissue culturing every year.(2) The average germinate rate of explants and the propagation coefficient of the tissue culture seedlings were higher than the untreated seedlings.The germinate rate of the explants which came from cutted and sprayed seedlings was 232% of CK.But the propagation coefficient of the tissue culture seedlings which came from seedlings treated with three treatments was 165% of CK.(3)As to the attaching functional value，the tissue culture seedlings from four different medium were evaluated,the WPM medium with 2% sugar and 1.0mg/L ZT were best for seedlings propagation.The propagation coefficient was as high as 9.61,which reached significant level comparing with other treatments.

Key words Fraxinus mandschurica; Sprout promoting; Rejuvenation; Micropropagation

收稿日期：2016-01-12

通讯作者：詹亚光（1963-），女，教授，博士生导师，博士，主要研究方向：植物生物技术。

作者简介：第1薛文辉（1987-），男，主要研究方向为植物生物技术。

文章编号：1001-9499（2016）02-0004-05

中图分类号：S792.41,S722.8

文献标识码：A