减小肝损伤白酒的研制及其质量控制

乐细选，杨　强，陈敬炳，童国强，管　莹，施　鹏，李先芝，祝　成(劲牌有限公司，湖北大冶435100)



减小肝损伤白酒的研制及其质量控制

乐细选，杨强，陈敬炳，童国强，管莹，施鹏，李先芝，祝成
(劲牌有限公司，湖北大冶435100)

摘要：将枸杞、山楂、葛根、木瓜等原料中提取出的功效成分，与白酒配制成具有减小肝损伤功能的产品。经过毒理学评价和功效学评价，结果表明，该酒体安全无毒，并能减少对四氯化碳所致的肝损伤，对肝脏具有辅助保护作用。用HPLC的方法测定减小肝损伤白酒中齐墩果酸的含量，齐墩果酸检测浓度范围：44.064～440.64 mg/L, Y=-0.01882222X3+36.14729X2+2942.488X，R2=0.9999，平均回收率为102.62 %，结果证明，该方法灵敏、简单、快速、稳定、效果较好。

关键词：减小肝损伤白酒；毒理学；功效学；齐墩果酸；HPLC；保健酒

中国酿造白酒已有4000多年的悠久历史，酒文化作为中华传统文化的一部分已经深入到社会的各个阶层，饮用白酒已成为中国人重要的生活习惯。白酒的主要成分是乙醇，乙醇可以促进血液循环、扩张皮肤血管、通经活络，适量饮用有利于人体健康，但长期不节制饮酒容易对人体的消化系统、特别是肝脏造成损伤。

基于健康的理念，我公司开发完成的减小肝损伤白酒是以枸杞、葛根、山楂、木瓜为原料[1-2]，通过科学的提取分离方法提取药材中的有效部位或有效成分，按一定的处方比例，以白酒为基体进行调配而成，使产品既具有白酒的风味风格、又具有减小肝损伤的保健功能。枸杞、葛根和山楂中的有效成分已经有比较完善的检测方法，本实验中则使用HPLC方法对木瓜中的主要成分齐墩果酸进行检测，以验证方法的适宜性。药理实验研究证明，齐墩果酸具有较显著的保肝作用[6-7]。

1　材料与方法

1.1样品

50 %vol白酒（劲牌有限公司生产，批号：20090701），枸杞（宁夏中宁），葛根（湖北罗田），山楂，木瓜（安徽宣城），齐墩果酸对照品（批号：110709—200304，中国药品生物制品检定检验所）。

1.2试剂与仪器

乙腈（色谱纯），纯净水，二次蒸馏水，微孔滤膜，针头过滤器，一次性注射器等，Prostar高效液相色谱仪，AB135-S电子天平（十万分之一），FA2004电子天平（万分之一）。

1.3实验方法

1.3.1减小肝损伤白酒的研制

1.3.1.1药材的提取

山楂提取物的提取：用乙醇回流提取法，称取干燥山楂，破碎，于70℃下按固液比1∶20加入70 %vol乙醇回流提取2 h，重复1次，合并提取液，滤液真空浓缩至浸膏，40℃真空干燥，称重，得山楂提取物。

枸杞提取物的提取：称取枸杞子，水洗干净后置于不锈钢锅中，用沸水保温浸泡24 h后，趁热用500目筛过滤，收集滤液，滤液减压浓缩至密度为1.0 g/ mL时加入1.5倍量的95 %vol乙醇,得沉淀物，收集沉淀物于80℃下鼓风干燥8 h，取出冷却、粉碎，得棕红色的枸杞(多糖)提取物。

葛根提取物的提取：取葛根粉碎成粗粉，加入8倍量70 %vol的乙醇，加热提取3次，每次1.5 h，温度为90℃，合并葛根提取液，回收乙醇，葛根提取浸膏，5倍水溶解，过滤，水液上101大孔树脂柱，水洗脱后用70 %vol乙醇洗脱，乙醇洗脱液，回收乙醇，减压干燥，得葛根提取物（葛根素粗品）。

木瓜提取物的提取：取木瓜粉碎成粗粉，用95 %vol乙醇提取3次，每次3 h，过滤，回收乙醇，至原料与溶剂的比例为1∶1，用水溶解，水不溶物用乙醇反复重结晶，得木瓜提取物（齐墩果酸）。

1.3.1.2酒体的配制

取山楂提取物、枸杞多糖提取物、葛根提取物和木瓜提取物按处方的比例溶于白酒，用0.1 %活性炭进行脱色，过滤即得。

1.3.2毒理学和功效学实验

1.3.2.1毒理学评价方法

急性毒性试验（Horn's法）：雌雄小鼠各25只，按体重随机分为5组（5雌5雄），以5种剂量进行喂养。各组动物经停食16 h后，一次性经口给予受试物，连续观察7 d，记录各组动物的中毒反应情况和死亡数，以确定该受试物对小鼠的半数致死剂量（LD50），解剖确定死亡原因。

遗传毒性实验（平板掺入法）：以多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝微粒酶（S9，经2-氨基芴鉴定合格）作为体外代谢活化系统，鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株TA97、TA98、TA100、TA102经his、△uvrB、rfa、R因子、PAQI质粒、自发回变等鉴定合格后，在37℃、120 r/min的条件下培养10 h，菌数达到1×109cfu/ mL后备用。在顶层培养基中加入0.1 mL实验菌株增菌液、0.1 mL受试物溶液和0.5 mL S9混合液（需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基上，37℃培养48 h，计数每皿菌落数。

1.3.2.2功效学评价方法

建立酒精性肝损伤模型，将适应性喂养3 d的小鼠，按体重随机分为6组（空白组、模型组、溶剂组、3个剂量组），各组数量均为10只。3个剂量组分别按人体推荐摄入量（1.67 mL/kg·bw）的10倍、20倍、30倍给予受试物，空白及模型对照组给予蒸馏水，溶剂对照组给予15 %vol酒精，灌胃容量10.0 mL/kg·bw。

实验期间每周称重2次，观察小鼠生长情况以及调整受试样品灌胃剂量。于实验第30天将模型对照组、溶剂对照组以及各剂量组一次性灌胃50 %vol酒精，灌胃量为12 mL/kg·bw，空白对照组给予相同剂量的蒸馏水，禁食16 h处死小鼠，取肝脏测定丙二醛（MDA），谷胱甘肽（GSH）及甘油三酯（TG），并进行病理组织学检测。

1.3.3齐墩果酸的测定方法

1.3.3.1色谱条件

C18柱为色谱分析用色谱柱，乙腈∶水（比例为75∶25）为流动相，流动相流速为1.0 mL/min，蒸发光散射检测器的漂移管温度为100℃，雾化气体氮气流速为2.5 L/min。

1.3.3.2对照品溶液的制备

取齐墩果酸标准品适量，用甲醇溶解，配制成1 mL含0.5mg/mL的甲醇溶液，然后稀释成不同浓度以建立标准曲线。

1.3.3.3供试品溶液制备方法

取50 mL减小肝损伤白酒样于60℃水浴旋转浓缩至干，用甲醇溶解，转移至10.0 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液备用，供试品溶液进样量为50 μL。

2　结果与分析

2.1减小肝损伤白酒的毒理学和功效学实验

2.1.1毒理学评价结论

通过急性毒性小鼠30 d喂养试验，减小肝损伤白酒对小鼠的半数致死剂量（LD50）＞200.0 mL/kg·bw，属实际无毒物质；测定结果显示各项生理、生化指标均在正常值范围内波动，病理切片中也没有发现有与受试物有关的毒性问题。

2.1.2功效学评价结论

小、中、大、超大剂量组小鼠肝细胞膜MDA含量明显降低（P＜0.05；P＜0.01），SOD、CAT和GSH-Px活性升高（P＜0.05；P＜0.01）；减小肝损伤白酒对大鼠血清AST有明显降低作用，肝脏病理切片结果显示，与模型对照组相比，气球样变程度减轻（p＜0.05），病变总评分（p＜0.05），能减少对四氯化碳所致的肝损伤而对肝脏具有辅助保护作用，4个剂量均能改善肝细胞的变性程度，具有抗酒精性肝保护作用，其作用机制与提高肝脏抗氧化功能有关。

2.2齐墩果酸的含量测定

2.2.1线性关系考察

配制不同浓度的齐墩果酸溶液进行色谱分析，得到各浓度的齐墩果酸色谱峰的峰面积，以浓度为横坐标，相对应的色谱峰面积为纵坐标建立标准曲线。结果表明齐墩果酸溶液浓度在44.064～440.64 mg/L时，与峰面积有良好的相关性，R2=0.9999，得到方程：

Y= -0.01882222X3+36.14729X2+2942.488X。

2.2.2精密度试验

选择线性范围实验中的浓度为176.256 mg/L的齐墩果酸标准物质，连续进样分析6次，得到各次分析的色谱峰面积，计算峰面积的RSD值。计算得到精密度实验的RSD值为0.84 %。结果表明，精密度良好。

2.2.3稳定性实验

选择线性范围实验中的浓度为176.256 mg/L齐墩果酸标品溶液，分别在0、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h进样分析，得到相应的峰面积，计算峰面积的RSD值。计算得到稳定性实验的RSD值为2.11 %。结果表明，供试品溶液在16 h内基本稳定。

2.2.4重复性实验

重复制备6个供试品溶液并进样测定，利用建立的标准曲线计算供试品溶液中齐墩果酸的含量。得到减小肝损伤白酒样品中齐墩果酸的含量为21.9276 mg/L，重复性实验的RSD值为1.45 %。结果表明，本检测方法重复性良好。

2.2.5回收率试验

吸取重复性实验中的减小肝损伤酒样品25.00 mL于茄形瓶中，各加入不同量的齐墩果酸对照品溶液，然后按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在确定的色谱条件下进行色谱分析，得到各供试品溶液的色谱峰面积，根据建立的标准曲线计算出各样品中齐墩果酸的量，再根据添加量计算出齐墩果酸的回收率，并计算回收率的RSD值。计算得到各添加量下的平均回收率为102.62 %，RSD值为3.12 %。具体数据见表1。

2.2.6样品的含量测定

共测定了6个批号的减小肝损伤白酒，齐墩果酸的平均含量为1.36 mg/L，结果见表2。

3　结论

3.1减小肝损伤白酒是以枸杞、葛根、山楂和木瓜等4味药食两用药材为原料，分别提取其中的功效成分枸杞多糖、葛根黄酮、山楂黄酮和齐墩果酸后配制而成的一种保健白酒，毒理学和功效学评价结果表明，本品无毒，且对小鼠血清AST有明显降低作用，能减少四氯化碳所致的肝损伤，对肝脏具有辅助保护作用。

3.2齐墩果酸是山楂和木瓜的功效成分之一，用HPLC方法测定齐墩果酸的含量，操作简便、节省时间、方法可靠。齐墩果酸在稀乙醇中溶解度低，故减小肝损伤白酒样品经回收乙醇后用甲醇溶解方能进行HPLC色谱分析。

表1 减小肝损伤白酒齐墩果酸加样回收试验结果(n=9)

表2 减小肝损伤白酒中齐墩果酸含量测定结果

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [M].北京：中医药科技出版社,2010.

[2]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社,2006.

[3]古赛,姜蓉.枸杞多糖对酒精性脂肪肝大鼠肝细胞色素P4503A的影响[J].重庆医科大学学报,2007,32(4)：371-375.

[4]周吉银,周世文.葛根总黄酮及葛根素解酒的药理研究进展[J].中国医院药学杂志，2007,27(9)：1280-1282.

[5]卓斌，谭泳怡.山楂的药理作用研究[J].亚太传统医药,2009, 5(3)：18-19.

[6]林丹,郭素华.木瓜化学成分、药理作用研究进展[J].海峡药学, 2009,21(10)：85-87.

[7]王晓峰,李继尧.齐墩果酸对肝损伤小鼠血清及肝细胞培养液转氨酶作用的研究[J].中国药学杂志,1999,34(6)：377-379.

白云边酒业获松滋市“2015年工业发展突出贡献奖”

本刊讯：2016年3月17日，2016年湖北省松滋市工业经济暨招商引资项目建设金融工作会议召开。会上，松滋市委、市政府对2015年度全市工业经济工作先进单位进行通报表彰。

湖北白云边酒业股份有限公司荣获“2015年工业发展突出贡献奖”，根据政企双方签订的《战略合作协议》，奖励676.7万元。2015年，白云边酒业按照年初确定的“强基础、补短板、提质效、增后劲”工作方针，以市场为导向，做真做实，以质取胜，开拓创新，在行业深度调整中站住了脚，稳住了阵，实现了逆势而上，稳中有进，稳中向好，促进了全市工业经济持续较快健康发展。

另悉，白云边酒业还获得了“工业企业参展和电子商务奖”“企业科技创新奖”。（王小波）

Development of Liver-Protecting Baijiu and Its Quality Control

YUE Xixuan, YANG Qiang, CHEN Jingbing, TONG Guoqiang, GUAN Ying, SHI Peng, LI Xianzhi and ZHU Cheng
(Jingpai Co.Ltd., Daye, Hubei 435100, China)

Abstract:The functional elements were extracted from Lycium chinense, Crataegus pinnatifida, Radix puerariae and Chaenomeles sinensis Koehne. Then they were blended with Baijiu to develop liver-protecting Baijiu. The efficacy and toxicology assessment showed that such Baijiu is safe without any toxic side-effects, and it has protective effects for carbon tetrachloride-induced liver damage. The content of oleanolic acid in the liquor was measured by HPLC (detection range within 44.064-440.64 mg/L, Y=-0.01882222X3+36.14729X2+2942.488X，R2=0.9999, and the average recovery was 102.62 %). Such measurement method was sensitive, simple, rapid, and effective.

Key words:liver-protecting Baijiu; toxicology; efficacy; oleanolic acid; HPLC; healthcare wine

作者简介：乐细选（1977-），女，产品开发员，开发方向：提取物在白酒中的应用研究。

收稿日期：2015-12-24

DOI：10.13746/j.njkj.2015478

中图分类号：TS262.91；TS261.4；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016)04-0062-03

优先数字出版时间：2016-02-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160226.1042.005.html。