UVB辐射对黑色素细胞黑素合成及其相关基因表达的影响

吴姗姗， 许欢欢， 朱丹丹， 居博伟， 闫　瑶， 杨建华

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐　830011; 2第一附属医院药学部， 乌鲁木齐　830054)



UVB辐射对黑色素细胞黑素合成及其相关基因表达的影响

吴姗姗1， 许欢欢1， 朱丹丹1， 居博伟1， 闫瑶2， 杨建华2

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐830011;2第一附属医院药学部， 乌鲁木齐830054)

摘要:目的研究UVB辐射对黑色素细胞增殖、黑素含量、酪氨酸酶活性及黑素合成相关基因表达的影响。方法原代分离培养黑色素细胞，采用MTT法测定不同强度UVB干预后细胞增殖率，L-DOPA法检测细胞中酪氨酸酶活性，NaOH裂解法测定黑素含量，RT-PCR检测黑素合成相关基因MITF、TRY、TRP-1、TRP-2的表达，以未经UVB辐照的细胞为空白对照组。结果与空白对照组相比,0.3 J/cm2 UVB模型组细胞增殖率显著增高(P<0.01)，酪氨酸酶活性明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)，细胞中黑素含量有显著增加的趋势，差异有统计学意义(P<0.01)。0.3 J/cm2 UVB干预后能显著上调细胞中黑素合成相关基因MITF、TRY、TRP-1、TRP-2 mRNA的表达。结论UVB辐射对黑素合成途径中相关基因的表达具有正向调控作用，细胞中黑素含量明显增加，对构建和优化理想的色素沉着细胞模型提供了参考依据。

关键词：UVB； 黑色素细胞； 酪氨酸酶活性； 黑素含量； 黑素合成相关基因

色素增加性皮肤病(雀斑、黄褐斑、老年斑等)是临床常见的皮肤顽疾，皮肤黑色素细胞中黑素合成过多是此类疾病发病的主要原因[1]。人体黑素的合成发生在黑色素细胞中特化细胞器的黑素小体内，以酪氨酸为底物，在酪氨酸酶的作用下合成黑素，正常的黑素合成和沉着具有保护皮肤、抵御紫外线辐射和防止内部组织过热等作用，而任一环节的缺陷或受某一因素的影响引起黑素合成的紊乱，都将导致一系列色素代谢障碍性疾病的发生[2]。紫外线是影响皮肤生物学效应的重要外界物理因素，作为一种强烈的外源性促细胞分裂剂，能引起黑色素细胞的增殖或凋亡以及黑素合成的增加[3-4]。日光中的紫外线由长波紫外线(UVA,320～400 nm)、中波紫外线(UVB， 280～320 nm)和(UVC，200～280 nm)组成。 UVC经过大气层时，几乎全部被臭氧层吸收，因此只有UVA和UVB会对人体产生物学效应。UVA对皮肤的作用持久而缓慢，是导致皮肤提前衰老的主要原因，UVB主要损害皮肤表皮层及真皮浅层，造成皮肤脱皮、红斑、粗糙、皱纹和色素沉着等[5]。本研究以人皮肤黑色素细胞为模型载体，选择UVB作为诱导因素复制色素沉着模型，考察不同UVB辐照强度干预对黑色素细胞增殖的影响，UVB作用后黑色素细胞中黑素的含量、酪氨酸酶的活性以及黑素合成相关基因小眼畸形转录因子(MITF)、酪氨酸酶(TRY)、酪氨酸酶相关基因-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关基因-2(TRP-2 )mRNA表达的影响，为构建和优化体外色素沉着模型提供参考依据。

1材料与方法

1.1试药幼儿包皮组织(由新疆医科大学第一附属医院门诊手术室提供)，254培养液(Gibco公司)，HMGS(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，上海生工生物公司)，0.25%胰酶(HyClone公司)，双抗(HyClone公司)，其他试剂均为分析纯。RNA抽提Trizol试剂盒(BBI公司)，DEPC(Gibco公司)，PCR引物 (上海生工生物技术有限公司)，First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo公司)，QuantiFast SYBR Green PCR Kit(Thermo公司)。

1.2仪器CO2恒温培养箱(Thermo公司)，Benchmark Plus全波长酶标仪(美国BIO-RAD)，IX71-12FL/PH倒置荧光研究级三目显微镜(日本Olympus)，高速多功能冷冻离心机(法国Jouan)，GeneAmp9600型PCR扩增仪(Perkin Elmer公司)，实时荧光定量仪(美国BIO-RAD)。

1.3实验方法

1.3.1原代正常黑色素细胞的分离培养将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的0.01 mol/L的PBS缓冲液彻底清洗2～3次，在无菌的条件下去除皮下脂肪和结缔组织，37℃下用0.25%的裂解酶分离表皮和真皮，并用吸头反复吹打，加入血清终止消化，将所得的表皮组织混悬液过100目过滤器过滤，去除未消化的组织细胞，将得到的细胞悬液离心，得到的沉淀即为多种表皮细胞，用254培养液清洗1次细胞后，接种到细胞培养瓶中，10～14 d黑色素细胞即可长满培养瓶。

1.3.2UVB致人皮黑色素细胞增殖剂量的选择接种于96孔板的待测细胞子照射前吸去培养基，用PBS液将细胞清洗2遍，加入100 μL PBS液置于紫外光源正下方，照射时间为0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s，经计算辐射强度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.、0.8、0.9 J/cm2。照射后用PBS液将细胞清洗1次，加入新鲜培养液，继续培养。间隔12 h再照射1次，照射2次后，观察照射2次后24、48 h细胞的增殖情况。MTT法测定细胞增殖率。

1.3.3UVB致人皮黑色素细胞黑色素颗粒含量的测定将培养的细胞调至浓度为2×105个/mL，以每孔2 mL铺于直径60 cm的培养皿中，4 h后细胞贴壁，用PBS液将细胞清洗2遍，加入500 μL PBS液置于紫外光源正下方UVB照射30 s，间隔12 h再照射1次，照射2次后培养24 h，用 0.25% 胰蛋白酶消化，将消化后的培养液收集入离心管，1 000 r/min离心 5 min。弃去上清，再用 PBS 液洗2次，然后加入100 μL浓度为 l mol/L NaOH，37℃水浴作用 8 h 充分碱裂解和溶解黑色素颗粒，再将反应体系溶液以100 μL/孔加入96孔板中，以酶标仪检测黑素特异性吸光度A470。

1.3..4UVB致人皮黑色素细胞酪氨酸酶活性抑制作用取对数生长期的人体黑色素细胞，调整细胞浓度为6×104个/mL，以200 μL/孔接种于24孔板细胞培养板中，UV照射30 s，培养12 h后再次UVB照射30 s，培养48 h后弃去培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入1%50 μL TrionX-100，迅速置于温度-80℃冻存30 min，随室温融化使细胞裂解，于37℃预温后加入0.25%多巴溶液10 μL，37℃水浴反应2 h，用酶标仪检测反应产物特异性吸光度A490。

1.3.5RT-PCR测定相关基因表达Trizol提取细胞中总RNA，使用核酸定量仪检测RNA的纯度和浓度，按照 First Strand cDNA Synthesis Kit对RNA样品进行反转录。RT-PCR反应所用引物的设计和合成根据参考文献[6]得到人MITF、TRY、TRP-1、TRP-2和β-actin基因序列，在Gene Bank中获取其相应的基因序列，将所查到的引物序列再在Gene Bank中BLAST，以再次证实其同源性和特异性见表1。按照QuantiFast SYBR Green PCR Kit的说明配制20 μL反应体系，反应条件见表2，读取Ct值。

表1　引物序列

表2　各基因PCR扩增反应条件

2结果

2.1黑色素细胞的鉴定采用DOPA染色法对分离培养的细胞进行鉴定，于培养的细胞中加入外源性左旋多巴，在酪氨酸酶作用下合成较多的黑素颗粒使细胞在显微镜下呈现黑色，提示分离培养的原代人皮黑色素细胞是成功的,见图1。

正常黑色素细胞

染色后黑色素细胞

图1黑色素细胞显微镜图(×100)

2.2UVB对人皮黑色素细胞增殖率的影响辐照后24 h与48 h 的细胞增殖率有明显差异，其中辐照后24 h， 0.6 J/cm2强度以上各组细胞增殖率较空白对照组明显下降，而0.6 J/cm2辐照强度以下细胞生长状态良好，和空白对照组细胞增殖率相比较差异无统计学意义。辐射48 h后， 0.4 J/cm2辐照强度以上UVB模型组细胞形态发生明显改变，贴壁细胞显著减少，细胞发生皱缩、破裂，与空白对照组比较细胞增殖率均有所下降；0.4 J/cm2辐照强度以下UVB模型组较空白对照组细胞增殖率均有所增高，其中0.3 J/cm2UVB模型组增殖作用最强，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。比较辐照24 h与48 h后细胞增殖率的变化，在0.1～0.4 J/cm2照射强度范围内，48 h模型组的增殖率均高于24 h模型组。综合考虑，最终选择0.3 J/cm2UVB辐照48 h构建细胞模型,见图2、3。

空白对照组

0.3 J/cm2UVB模型组

0.9 J/cm2UVB模型组

图2UVB辐射黑色素细胞48 h显微镜图

2.3两组酪氨酸酶活性及黑色素含量比较与空白对照组比较，0.3 J/cm2UVB模型组酪氨酸酶活性明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)，UVB照射可使人皮黑色素细胞的黑素含量有显著增加的趋势，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3UVB对细胞中酪氨酸酶活性及黑素含量的

组别酪氨酸酶活性A490(OD)黑素含量A470(OD)空白对照组1.0895±0.07820.2348±0.0301UVB模型组1.5973±0.0190*0.3552±0.0268**

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01。

2.4RT-PCR测定相关基因表达0.3 J/cm2UVB干预后能显著上调细胞中的MITF、TRY、TRP-1、TRP-2mRNA的表达，UVB模型组MITF的表达为空白对照组的1.46倍(P<0.05)，TYR的表达为空白对照组的5.38倍(P<0.01)，TRP-1的表达为空白对照组的8.04倍(P< 0.01)，TRP-2的表达为空白对照组的2.35倍(P<0.01) ，见图4。

3讨论

有研究表明，由于黑色素瘤细胞株较易获得、培养简便，故很多研究以小鼠或人黑色素瘤细胞作为色素沉着的模型载体[7]。本研究采用原代培养的人皮肤黑色素细胞为实验模型，虽然该细胞株的分离、培养、鉴定较黑色素瘤细胞复杂、繁琐，但其可保持人皮黑色素源细胞一定的结构、性状和功能，能较真实地反映人体皮肤的正常生理状况，是研究和评价化合物对皮肤黑色素细胞黑素合成影响及机制探讨较为理想的细胞模型，故以其为载体建立色素沉着细胞模型。现已知至少有3种酪氨酸酶基因家族成员即TRY、TRP-1、TRP-2参与和决定黑素合成的调控[8-9]。这3种基因都有1个跨膜区，尽管有相似的结构和特征，但却有不同的基因表达和拥有独特的酶活性。TYR对黑素的合成至关重要，其是黑色素细胞中催化黑素生成的限速酶。TRP-1和TRP-2也参与黑素生成的酶过程，同时对维持酪氨酸酶在黑素体膜上的稳定和阻止未成熟的黑色素细胞死亡具有重要作用。MITF是黑色素细胞重要的转录因子之一，在皮肤黑素生成过程中，MITF作为分子开关，可转录调控TYR、TRP-l和TRP-2[10]。

本研究结果显示，0 ～ 0.4 J/cm2UVB强度下的UVB辐射对黑素合成具有正向调控作用，可以促进细胞增殖，酪氨酸酶活性及黑素含量均显著增加，并能够不同程度地上调细胞中的MITF、TRY、TRP-1、TRP-2mRNA的表达，提示UVB辐射可以造成色素沉着。而随着辐射剂量的逐渐增大，辐射强度> 0.4 J/cm2UVB时，细胞增殖呈现下降趋势，说明过量的紫外线会损伤黑色素细胞，造成细胞的凋亡。虽然黑素具有遮挡紫外线辐射的功能，但黑素在皮肤的堆积也会演变为严重的皮肤疾病和审美问题，减少了患者的社会功能，给患者身体和心理带来严重的痛苦和伤害。随着“回归大自然”的理念日渐深入人心，天然美白防晒产品的开发已成为化妆品领域一个研究热点。本课题组前期研究发现，肉苁蓉苯乙醇苷对蘑菇酪氨酸酶的活性具有明显的抑制作用，提示可能有减少黑素生成的作用[11]。本研究在此基础上，通过体外培养黑色素细胞，筛选不同强度的UVB辐射对细胞的影响，最终选择0.3 J/cm2UVB强度构建色素沉着模型。本实验UVB辐射细胞模型的构建和优化为后续研究评价苯乙醇苷类对黑素合成的影响及机制探讨提供了理论依据。

参考文献:

[1]Brenner M, Berking C. Principles of skin pigmentation. Biochemistry and regulation of melanogenesis[J]. Novye Issledovaniya Psikhologii, 2010, 61 (7): 554-560.

[2]Lee TH, Seo JO, Do MH, et al. Resveratrol-enriched rice down-regulates melanin synthesis in UVB-induced guinea pigs epidermal skin tissue[J]. Biomol Ther, 2014, 22 (5): 431-437.

[3]Wonseon C, Yoshinori M, Rainer W, et al. Regulation of human skin pigmentation in situ by repetitive UV exposure: molecular characterization of responses to UVA and/or UVB[J]. J Invest Dermatol, 2010, 130 (6): 1685-1696.

[4]Takahiro N, Tomoko N, Tomohiko S, et al. Hyperbaric oxygen improves ultraviolet B irradiation-induced melanin pigmentation and diminishes senile spot size[J]. Skin Res Technol, 2011, 17 (3): 332-338.

[5]Rainer W, Kathrin S, Kazumasa W, et al.Pigmentation effects of solar simulated radiation as compared with UVA and UVB radiation[J]. Pigment Cell Melanoma Res, 2008, 21(4):487-491.

[6]Lee MH, Lin YP, Hsu FL, et al. Bioactive constituents of Spatholobus suberectus in regulating tyrosinase-related proteins and mRNA in HEMn cells[J]. Phytochemistry, 2006, 67 (12): 1262-1270.

[7]Kim SS, Kim MJ, Chio YH, et al. Down-regulation of tyrosinase, TRP-1, TRP-2 and MITF expressions by citrus press-cakes in murine B16 F10 melanoma [J]. Asian Pac J Trop Biomed, 2013, 3 (8): 617-622.

[8]Fabrice J, Ghanem G. Tyrosinase related protein 1 (TYRP1/gp75) in human cutaneous melanoma[J]. Mol Oncol, 2011, 5 (2): 150-155.

[9]Lee EJ, Lee YS, Soonho H, et al. N-(3,5-dimethylphenyl)-3-methoxybenzamide (A(3)B(5)) targets TRP-2 and inhibits melanogenesis and melanoma growth[J]. J Invest Dermatol, 2011, 131 (8): 1701-1709.

[10]黎钊, 王平, 洪为松, 等. 正常人黑素细胞MITF对酪氨酸酶相关蛋白的转录调控研究[J]. 医学研究杂志, 2013, 42 (3): 58-62.

[11]杨建华, 胡君萍, 热娜·卡斯木, 等. 肉苁蓉苯乙醇苷对酪氨酸酶活性的抑制作用[J]. 华西药学杂志, 2010, 25 (10): 533-535.

(本文编辑施洋)

Effect of UVB radiation on melanocytes and melanin synthesis-related gene expression

WU Shanshan1, XU Huanhuan1, ZHU Dandan1, JU Bowei1, YAN Yao2, YANG Jianhua2

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo study the UVB radiation on melanoma cell line proliferation, melanin content and tyrosinase activity and related gene expression. MethodsAfter different intensities of UVB intervention to primary cultured melanocytes, the cell proliferation rate was detected by MTT assay. Cells tyrosinase activity was detected by L-DOPA assay and melanin content was detected by NaOH lysis assay. RT-PCR was used to detectthe expression of mRNA of MITF, TRY, TRP-1, TRP-2. Without UVB irradiation group was the control group. ResultsCompared to the control group, in 0.3J/cm2 UVB intervention melanocytes group，cell proliferation rate and tyrosinase activity increased significantly，and the difference were statistics significance (P<0.01 and P<0.05). And cell melanin content had significantly increasing trend, and the difference was statistically significant (P<0.01). 0.3 J/cm2 UVB intervention can significantly increase the mRNA expression of MITF, TRY, TRP-1, TRP-2 in cells. ConclusionUVB radiation has a positive effect on the regulating genes expression which are related to the melanin synthesis pathway and the melanin significantly increased in the cells, which provide more information for constructing pigmentation models .

Key words:UVB; melanocytes; tyrosinase activity; melanin content; melanin synthesis-related gene

[收稿日期：2015-12-8]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.04.009

中图分类号：R34

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)04-0422-05

作者简介：吴姗姗(1990-), 女，在读硕士,研究方向：新疆特色药用植物开发利用研究。通信作者：杨建华, 男(壮族)，博士，教授，硕士生导师，研究方向：新疆特色药用植物开发利用研究，E-mail: 609571241@qq.com。

基金项目：国家自然科学基金(81360670, 81060333); 新疆维吾尔自治区优秀青年科技创新人才培养工程项目(2014721050)