响应面法优化怀山药水溶性蛋白提取工艺的研究

◎付琴琴

（晋中市粮油检测中心，山西 晋中 030600）

山药为薯蓣科薯蓣属植物薯蓣块茎，为药食同源保健食品，具有降血糖血脂、抗肿瘤、抗突变、抗氧化、免疫调节等功能[1]。学者们对本土山药研究较多，如蛋白体内和体外抗氧化活性[2]、免疫调节活性及对血管紧张素转化酶的非竞争性抑制作用[3]。国内学者研究主要集中于山药种植技术、多糖提取及活性及深加工[4]等领域。本实验以怀山药（Dioscorea opposita polysaccharide，DOPS）为原料，研究其水溶性蛋白质的提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

怀山药，产自河南温县；浓硫酸、氢氧化钠、盐酸等试剂均为分析纯。

SPD80型凯氏定氮仪，北京三品科创仪器有限公司；DS-1型高速组织捣碎机，上海双旭电子有限公司；DZKW-4型水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司。

1.2 测定方法

蛋白含量的测定均采用凯氏定氮法。

蛋白提取率=（提取液中蛋白浓度/山药汁中蛋白浓度）×100%。

1.3 实验方法

1.3.1 山药汁样品制取和山药蛋白提取

怀山药表面清洗擦净，去皮，均浆，得到山药汁样品。取上述样品10 mL于三角瓶，按一定水料比加入蒸馏水，一定温度下提取一定时间，4 000 r/min离心10 min，取上清液。分别取10 mL山药汁样品和10 mL提取液进行凯式定氮试验。

1.3.2 蛋白质含量的测定

蛋白含量[4]（g/mL）

式（1）中，V：消耗HCl，mL；V0：空白实验时消耗的HCl，mL；N：HCl当量浓度；A：固定系数，6.25；W：样品体积，mL。

2 结果与分析

2.1 山药汁样品蛋白含量测定结果

测定V为0.53 mL，V0为0.1 mL，N 为 0.01 mol/L。带入公式（1）得山药汁中蛋白质含量为0.376 mg/mL。

2.2 单因素试验

2.2.1 水料比选择试验

提取温度55 ℃，提取时间60 min，水料比分别2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1，提取1次，比较水料比对提取效果影响，结果如图1所示。

由图1可知水料比增大蛋白提取率也增大，水料比增至8∶1后提取率减小。水料比过低，水分加入量少，混合液黏度较高，蛋白不易析出。水料比过高，加水量多给后续浓缩增加工作量，确定水料比8∶1。

图1 水料比对提取效果影响图

2.2.2 提取温度的选择试验

水料比6∶1，提取时间60 min，提取温度分别为15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃和55℃，提取1次，考察提取温度对提取效果影响，结果如图2所示。

由图2可知，随提取温度提高蛋白提取率增大，达到35 ℃以后，提取率迅速减小。低温条件下，蛋白质不能充分溶于水，提取不充分；温度升高，蛋白与水作用加强，提取率可能升高；温度过高，蛋白结构解体，蛋白分子变性凝固沉淀，确定提取温度35 ℃。

图2 提取温度对提取效果影响图

2.2.3 提取时间的选择试验

水料比6∶1，提取温度55 ℃，依次提取30、60、90、120min和150min，提取1次，考察提取时间对提取效果影响，结果如图3所示。

由图3可知蛋白析出量最初随时间增加上升，60 min后开始下降，下降幅度趋于平缓，表明开始时，蛋白析出速率快，之后降低可能与多糖、多酚等结合的蛋白还未析出；延长提取时间，细胞充分溶胀，蛋白质易溶出；时间过长，蛋白颗粒间作用力增强，易变性凝集沉淀。确定提取时间为60 min。

图3 提取时间对提取效果影响图

2.2.4 提取次数的选择试验

水料比1∶6，提取温度55 ℃，提取时间60 min，依次提取1、2、3、4和5次，考察提取次数对提取效果影响，结果如图4所示。

由图4可知，提取1次蛋白提取率最高，随着提取次数增加，提取率急剧下降，以提取1次为宜。

图4 提取次数对提取效果影响图

2.3 响应面分析及提取工艺优化

2.3.1 数学模型建立与检验

根据单因素试验结果，提取1次蛋白提取率最高，选择水料比、提取温度和提取时间3个因素，利用Design-Expert 7.1.6软件中心组合设计选项，共有17个试验点，响应面分析因素和水平见表1。

表1 响应面因素水平表

对17个试验点的结果统计分析，得到二次回归方程：

各变量对响应值影响显著程度由F检验判定，P值越小，显著程度越高[5]。该试验模型方程F值13.03，P＜0.05，整体模型显著，失拟项不显著，说明该回归模型可靠，与实测值拟合良好，可用于蛋白提取条件分析和预测。

2.3.2 各因素影响程度分析

F值大小可判定各因素对蛋白提取率影响程度。F值越大对指标影响越强[6]。对个因素进行回归方程方差分析，结果见表2。表2中，FXl=55.93，FX2=4.94，FX3=2.61，各因素影响程度顺序为：水料比＞提取温度＞提取时间。方程一次项X1回归系数极显著，说明水料比对蛋白提取率有极显著影响；交互项中的X1X3项表现出了高度显著水平，说明水料比和提取时间的交互作用对提取率有显著影响。

表2 回归方程方差分析表

2.3.3 响应面分析

响应面图能直观反映各因素对响应值影响及交互作用程度[7]。为考察交互作用对蛋白提取率影响，对模型降维分析。经Design-Expert 7.1.6软件分析，可得到二次方程响应曲面图，如图5、图6、图7所示。

由图5-7可知，在所选试验范围内，各因素均有极点；曲面陡峭程度可看出水料比影响最大，提取温度次之，提取时间影响最小；等高线图近似椭圆形，说明因素间有一定交互作用，结果与回归分析吻合[8]。

图 5 Y=f（X1，X2）的响应面

图 6 Y=f（X2，X3）的响应面

图 7 Y=f（X1，X3）的响应面

2.3.4 模型验证

为验证响应面法的可靠性，采用最优条件试验，水料比8.25∶1，提取温度35.18 ℃，提取时间60.26 min，提取次数1次，试验重复3次，实际测得蛋白含量0.244 mg/mL，蛋白提取率64.9%，理论预测值0.253 mg/mL，蛋白提取率65.4%，相对误差为－0.7%。

3 结论

怀山药水溶性蛋白提取单因素试验和响应面试验确定最佳工艺条件为水液料比8.25∶1，提取温度35.18 ℃，提取时间60.26 min，提取次数1次，蛋白质提取率可达到64.9%。

参考文献：

[1]袁书林.山药的化学成分和生物活性作用研究进展[J].食品研究与开发，2008，29（3）：176-179.

[2]孙芝杨，杨振东，焦宇知.淮山药蛋白质的提取及抗氧化作用的研究[J].食品科技，2013，38（10）：232-235.

[3]HSU F L， LIN Y H，Lee Meihsien，et al.Both dioscorin， the tuber storage protein of yam （Dioscorea alata Tainong No.1）， and its peptic hydrolysates exhibited angiotensin converting enzyme inhibitory activities[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（21）：6109-6113.

[4]李月仙，黄东益，黄小龙，等.山药的研究进展[J].中国农学通报，2009，25（9）：91-96.

[5]王岸娜，刘小彦，吴立根，等.猕猴桃蛋白质的分离及类型鉴定[J].河南工业大学学报，2009，30（8）：25-29.

[6]赵 翔，陆启玉，章邵兵，等.水剂法同时提取花生油和蛋白质的工艺研究[J].农业机械，2012（12）：35-37.

[7]冯 晞，诸爱士，刘珊珊.响应面法优化大黄米多糖提取工艺[J].粮食与油脂，2016，29（3）：57-60.

[8]王若兰，赵海波.响应面优化燕麦中抗氧化物质的提取工艺[J].粮食与油脂，2016，29（1）：41-44.