新型全反式维甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对肝癌细胞株 HepG2增殖的影响

刘 慧，周 青，汪 渊

新型全反式维甲酸衍生物 4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对肝癌细胞株 HepG2增殖的影响

刘 慧，周 青，汪 渊

目的研究 4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯 （ATPR）对人肝癌细胞株 HepG2增殖的影响，并初步探讨其可能的作用机制。方法选取 HepG2细胞为研究对象，全反式维甲酸（ATRA）和 ATPR分别作用细胞，应用 MTT比色法测定细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期分布情况，Western blot法检测 HepG2细胞内周期蛋白 D（cyclinD）及细胞周期蛋白依赖性激酶 4（CDK4）和 CDK6蛋白表达量。结果ATPR能够显著抑制 HepG2细胞的增殖，将细胞阻滞在 G0／G1期，呈浓度与时间依赖性（P＜0.05），并且同浓度、同一处理时间下，ATPR的抑 制率更高（P＜0.05）；此外，Western blot结果显示，ATPR较 ATRA更能显著下调 HepG2细胞中cyclinD和 CDK6蛋白表达水平（P＜0.05），而 CDK4蛋白水平在各组变化均不明显。结论同等浓度下，ATPR抑制HepG2细胞增殖的效果明显强于 ATRA，其机制可能是 ATPR通过下调 cyclinD和 CDK6蛋白的表达水平，造成 G0／G1期阻滞，最终导致肝癌细胞株 HepG2的增殖抑制。

肝癌；HepG2细胞；全反式维甲酸；4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯；细胞周期；细胞增殖

全 反 式 维 甲 酸 （all-trans retinoic acid，ATRA）（图1）是维生素 A的主要活性代谢物，为维甲酸类药物的代表，可诱导分化多种肿瘤细胞，已被广泛用于治疗急性早幼粒细胞性白血病［1］。Sait et al［2］发现 ATRA能上调肿瘤细胞中的血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），促进肿瘤血管的生成而引起恶性增殖。此外，ATRA还可产生较强的维甲酸综合征，长期使用会产生维甲酸抵抗，限制了其在肿瘤治疗中的作用［3］。因此，开发低毒高效的新型维甲酸衍生物是必需的。4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯 （4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR）（图2）是由本校合成的新型维甲酸衍生物，研究［4-6］表明在抑制细胞迁移与诱导分化和凋亡方面，ATPR效果明显优于 ATRA。然而关于 ATPR对肝癌细胞株 HepG2增殖的研究较少，相关的机制尚不清楚。该研究以肝癌细胞株 HepG2为模型，通过比较 ATRA与 ATPR对其增殖能力的影响，为新型维甲酸衍生物用于肝癌临床治疗提供科学依据。

图1 ATRA结构式

图2 ATPR结构式

1 材料与方法

1.1 材料人肝癌细胞株 HepG2购自美国 ATCC公司；ATPR由安徽医科大学药学院提供；ATRA、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自美国 Sigma公司；低 糖 DMEM 培养基购自美国 Gibco公司，4℃储存备用；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，-20℃保存，用前 4℃融化，无需灭活；Coulter DNA检测试剂盒购自美国 Beckman Coulter公 司；鼠 抗 人 β-actin购 自 美 国 Santa Cruz公司；鼠抗人 cyclinD、CDK6以及兔抗人 CDK4抗体购自上海联世生物科技有限公司；辣根过氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠 IgG、羊抗兔 IgG、ECL显色试剂盒以及 BCA定量试剂盒均购自美国 Pierce公司。ATRA、ATPR用 DMSO溶解配制成 20 mmol／L，-20℃避光保存，使用时用完全培养基稀释至使用浓度。

1.2 方法

1.2.1细胞株以及细胞培养 人肝癌细胞株HepG2用含 10%新生牛血清的低糖 DMEM培养基，并加入青霉素 100 U／ml和链霉素 100μg／m l，在 37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。每 2～3 d换一次液，当细胞密度达 80% ～90%，用 0.25%胰酶（含 0.53 mmol／L EDTA）传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2细胞增殖实验（MTT法） 收集对数生长期细胞，以 2.5×107／L的密度接种于 96孔板，每孔200μl，边缘孔用 200μl PBS填充。待细胞贴壁后弃去培养液，用 PBS轻洗 3遍，然后分别加入含有不同浓度（5、12.5、20、25、50、75、100μmol／L）的ATRA和 ATPR的培养液孵育 48 h，以及同一浓度（25μmol／L）ATRA和 ATPR处理不同的时间（24、48、72、96 h），并设置细胞对照组、溶剂对照组（DMSO），其中溶剂对照组是与最大浓度 100μmol／L药物中所含有的 DMSO等体积，其他药物组均将 DMSO体积补齐至最大体积，以消除各组溶剂体积不同所造成的干扰。指定作用时间后，每孔加入 20μl MTT，于细胞培养箱中孵育 4～6 h。小心弃去上清液，每孔加入 100μl DMSO，37℃振动 15 min以溶解结晶，酶 标 仪 检 测 570 nm 波 长 吸 光 度 （optical density，OD）。每个浓度设置 6个复孔，做 3次实验，取平均值。抑制率（%）=（对照组 OD570-试验组 OD570）／对照组 OD570×100%。用 SPSS 16.0计算药 物 的 半 数抑制浓度 （half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3流式细胞术检测细胞周期 收集处于对数生长期的 HepG2细胞，接种于 6孔板，待细胞贴壁后换成无血清培养基饥饿24 h，使细胞周期同步化，然后用含 25μmol／L的 ATRA和 ATPR的完全培养液处理细胞，48 h后常规消化收集各组细胞，预冷PBS洗3次后，用100μl PBS重悬并调整细胞密度为 1×106／ml。按 Coulter DNA检测试剂盒操作，每组加入50μl固定破膜剂，反应30 s后立即加入500 μl PI染液，室温避光反应 30 min后用流式细胞仪检测，每个标本检测 105个细胞，重复计数 3次，由ModFIT软件分析 G0／G1、S、G2／M期细胞比例。

1.2.4Western blot检测蛋白表达 5、25μmol／L的 ATRA和 ATPR分别处理 HepG2细胞 48 h后，取出细胞，用预冷的 PBS洗涤 3遍，在滤纸上控干PBS，并吸去残余 PBS。然后每组加入 200μl蛋白提取缓冲液（Tris-HCl，pH 7.14，150 mmol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，1%Triton X-100，0.1%SDS，5 mg／ml Leupeptin，1 mmol／L PMSF），冰 上 放 置 20 min后，置冰上用细胞刮刮取细胞，移入 1.5 ml EP管，并反复冻融 3次（-80℃、4℃）。之后，在超速冷冻离心机中 4℃、14 000 r／min离心 30 min，吸取上清液，使用 BCA试剂盒定量，用生理盐水调整至相同浓度后，加入等体积的 4×蛋白上样缓冲液，煮沸 8～10 min，-80℃保存待用。等量的各组样品用于 SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移到 PVDF膜上。转膜成功后，室温下用含 5%的脱脂奶粉封闭2 h或者4℃封闭过夜，接着将膜放入用一抗稀释液配制的一抗中，4℃孵育过夜。经 TBST（含 0.05% Tween-20）洗涤 3遍后加入相应浓度 HRP标记的二抗室温孵育 2 h，用 TBST洗涤 3遍后，TBS洗涤 1遍，每遍 10 min。在暗室中将等比例混合后的 ECL试剂 A液和 B液均匀涂于膜上，X线片曝光，显影，定影。底片扫描后使用 Quantity One软件分析条带的灰度值。

1.3 统计学处理采用 SPSS 16.0软件进行分析，实验数据均以 ¯x±s表示；组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t检验。

2 结果

2.1 ATRA和ATPR对HepG2细胞增殖的影响

MTT结果显示，当细胞经不同浓度的 ATRA和ATPR处理 48 h后，与细胞对照组相比，低浓度的ATRA组（5、12.5、20、25μmol／L）对细胞无抑制作用，当作用浓度升至 50μmol／L，开始以剂量依赖方式抑制 HepG2细胞株的增殖（FATRA=53.919，P＜0.05），而 ATPR组从低浓度到高浓度均能抑制细胞的生长，并呈浓度依赖关系（FATPR=8 269.029，P＜0.05），见图3。通过 SPSS 16.0计算出 ATRA和ATPR的 IC50分别为 102.190、31.723μmol／L。随后选取 25μmol／L药物浓度分别作用于 HepG2细胞24、48、72、96 h，随着药物处理时间的延长，抑制率逐渐升高。相比之下，同一处理时间下 ATPR较ATRA的抑制率更高（F24h=44.499，F48h=271.387，F72h=1 479.019，F96h=2 130.531，P＜0.05），见图4。以上结果均提示，与同一浓度的 ATRA相比，ATPR对 HepG2细胞增殖抑制作用更强。

图3 不同浓度的 ATRA及 ATPR对 HepG2细胞增殖的作用1：细胞对照组；2：溶剂对照组；3：5μmol／L；4：12.5μmol／L；5：20μmol／L；6：25μmol／L；7：50μmol／L；8：75μmol／L；9：100μmol／L；与细胞对照组比较：*P＜0.05

图4 ATRA和 ATPR对 HepG2细胞增殖的作用1：细 胞对 照组；2：溶 剂 对 照 组；3：ATRA 25μmol／L；4：ATPR 25 μmol／L；与细胞对照组比较：*P＜0.05；与同一时间的 ATRA组比较：＃P＜0.05

2.2 ATRA以及ATPR对HepG2细胞周期的影响25μmol／L ATRA和 ATPR处理 HepG2细胞 48 h后，流式细胞术检测细胞周期显示，与溶剂对照组相比，25μmol／L的 ATPR能够显著抑制 HepG2细胞增殖（P＜0.05），使 G0／G1期细胞的比例明显增加，而 同 浓 度 的 ATRA 组 无 明 显 作 用 （FG0／G1= 123.523，FS=74.587，FG2=63.385），见图5。以上结果提示 ATPR能将 HepG2细胞周期阻滞在 G0／G1期，从而抑制细胞增殖。

2.3 ATRA及ATPR对HepG2细胞中cyclinD、CDK 4和CDK 6蛋白水平的影响5、25μmol／L ATRA和 ATPR作用细胞 48 h后，与细胞对照组相比，ATPR能明显下调 cyclinD与 CDK6的水平（P＜0.05），而 ATRA 组 变 化 不 显 著 （FcyclinD=65.190、FCDK6=65.651）。同时，CDK4蛋白的表达水平在各组中均变化不明显（FCDK4=5.298），见图6。

3 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，经治疗的早期肝癌，5年生存率仅为 50%，占恶性肿瘤死亡率的第二位［7-8］。除手术切除外，药物化疗是治疗肝癌的重要手段，但由于疗效缺乏特异性，并且长期用药会产生 耐 性，从 而 影响了药物 治 疗 效 果［9］。因此，寻找高效、安全的新型抗癌药是必要的。本实验室采用的 ATPR是在 ATRA的结构基础上进行羧基改造而成。研究［4-5，10］证实，ATPR可以有效抑制肺癌细胞株 A549、胃癌细胞株 BGC-823以及乳腺癌细胞株 MDA-MB-231的迁移。

细胞增殖是通过细胞分裂方式增加细胞数量的复杂过程，是细胞生命活动的重要特征之一。然而，当正常细胞在多种因素的影响下，细胞周期调节失控，获得自主生长信号，导致细胞无限增殖，就会产生肿瘤［11］，肝癌的发生发展也是肝癌细胞无限增殖的结果。因此，该文主要从细胞增殖方面，研究 ATRA与新型维甲酸衍生物 ATPR对肝癌 HepG2细胞株的作用。MTT实验显示，ATPR从低浓度到高浓度（5～100μmol／L）均能够抑制 HepG2细胞的增殖，有浓度依赖性和时间依赖性，抑制率远远高于同等浓度下的 ATRA，即在相同浓度与作用时间下，ATPR抑制 HepG2细胞增殖的能力比 ATRA更强。

图5 ATRA与 ATPR对肝癌 HepG2细胞周期的影响A：溶剂 对照组 ；B：ATRA 25μmol／L；C：ATPR 25μmol／L；与溶 剂对 照组 比较：*P＜0.05

图6 ATRA和 ATPR对 HepG2细胞 内 cyclinD、CDK 4和 CDK 6蛋白表达的影响1：细胞对照 组 ；2：溶 剂 对 照 组 ；3：ATRA 5μmol／L；4：ATRA 25 μmol／L；5：ATPR 5μmol／L；6：ATPR 25μmol／L；A：ATRA和 ATPR对HepG2细胞内 cyclinD蛋白的影响；B：ATRA和 ATPR对 HepG2细胞内 CDK4和 CDK6蛋白表达的影响；与细胞对照组比较：*P＜0.05；与相同浓度的 ATRA组比较：＃P＜0.05

细胞周期检测点是细胞增殖调控的关键位点，包括细胞周期蛋白 cyclin和细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK的调控系统［11］。流式细胞术检测细胞周期发现，ATPR可以显著导致 HepG2细胞阻滞在 G0／G1期，抑制细胞增殖，这与MTT结果是一致的。CyclinD蛋白在细胞增殖过程中发挥重要作用，是调节 G1期细胞增殖信号的关键蛋白，其可与 CDK4或CDK6形成激酶复合物，使关键底物 PRb磷酸化，加快释放转录因子 E2F，从而加速 G1／S期转换［11-12］。细胞周期的失控会导致细胞恶性增殖，从而导致癌症［11，13］，因此，开发抗癌药物来抑制细胞周期的进程显得尤为重要。有研究［14］表明，在食管癌细胞株EC-9706和乳腺癌细胞株 MDA-MB-231中，通过抑制 cyclinD和 CDK4的水平，能够诱导细胞 G0／G1期阻滞，从而抑制细胞增殖。因此，本研究检测了 cyclinD、CDK4和 CDK6蛋白，结果显示，经 ATPR处理48 h后的 HepG2细胞 cyclinD和 CDK6表达降低，而 CDK4蛋白水平恒定。因此，ATPR可能通过下调 cylinD和 CDK6蛋白水平来减少 cyclinD和 CDK6复合物的形成，抑制细胞周期 G1向 S期转变，致使细胞阻滞在 G0／G1期，最终实现对 HepG2细胞的增殖抑制作用。

本实验研究中，ATRA较其衍生物 ATPR对 cyclinD及 CDK6的抑制能力较弱，这可能与二者调节肝癌 HepG2细胞增殖方面存在不同的作用机制有关。研究［15］显示 ATRA及其衍生物通过其核受体发挥抗癌作用，目前已发现两种维甲酸受体家族：RARs和 RXRs家族，分别都有 α、β、γ3个亚型。ATRA与其衍生物通过与细胞内相应维甲酸受体结合后，特异性结合到靶基因调控区的维甲酸应答元件（RARE）上，选择性地激活或抑制基因转录，调节细胞的增殖、分化和凋亡［15］。研究［5］证明 在胃癌BGC-823细胞中，ATPR较 ATRA能显著下调 RARα和 RARβ受体，导致 ATPR抑制 BGC-823细胞迁移的能 力 更 强。因 此，ATRA 与 ATPR 调 节 肝 癌HepG2细胞增殖机制的不同可能与其进入 HepG2细胞内结合不同的维甲酸受体有关，二者对受体调节的研究也正在本实验室进行。

综上所述，在同等浓度下，新型维甲酸衍生物ATPR较 ATRA更能显著抑制肝癌细胞株 HepG2的增殖。其机制可能是通过下调 cyclinD和 CDK6的表达水平阻滞 HepG2细胞周期进展，从而抑制细胞增殖，为肝癌的药物治疗提供了新的实验依据。然而，细胞增殖是一个极其复杂且受严格调控的过程，ATPR如何下调 cyclinD和 CDK6的机制以及相关通路仍不清楚，有待后续研究进一步探讨。

［1］Siddikuzzaman，Guruvayoorappan C，Berlin Grace V M.All trans retinoic acid and cancer［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33（2）：241-9.

［2］Saito A，Sugawara A，Uruno A，et al.All-trans retinoic acid induces in vitro angiogenesis via retinoic acid receptor：possible involvement of paracrine effects ofendogenous vascular endothelialgrowth factor signaling［J］.Endocrinology，2007，148（3）：1412-23.

［3］Su Y C，Dunn P，Shih L Y，et al.Retinoic acid syndrome in patients following the treatmentof acute promyelocytic leukemiawith all-trans retinoic acid［J］.Chang Gung Med J，2009，32（5）：535-42.

［4］Fan T T，Cheng Y，Wang Y F，et al.A novel all-trans retinoid acid derivative N-（3-trifluoromethyl-phenyl）-retinamide inhibits lung adenocarcinoma A549 cell migration through down-regulating expression ofmyosin light chain kinase［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（18）：7687-92.

［5］Hu A，Yang Y，Zhang S，et al.4-Amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate inhibits themigration of BGC-823 human gastric cancer cells by downregulating the phosphorylation level of MLC II［J］.Oncol Rep，2014，32（4）：1473-80.

［6］周佳丽，颜蕴文，江巧玲，等.全反式维甲酸及其衍生物对乳腺癌细胞株 MDA-MB-231凋亡的影响［J］.安徽医科大学学报，2015，50（2）：154-8.

［7］Koudah S，EIMouhadi S，ArrivéL.Fibrolamellar hepatocellular carcinoma［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2012，36（1）：5-6.

［8］Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］. CA Cancer JClin，2011，61（2）：69-90.

［9］Abrams P，Marsh JW.Current approach to hepatocellular carcinoma［J］.Surg Clin North Am，2010，90（4）：803-16.

［10］王 北，颜韵文，周 青，等.4-氨基-2-三氟甲基维甲酸酯对乳腺癌细胞株 MDA-MB-231迁移的影响及其可能机制［J］.安徽医科大学学报，2013，48（2）：115-9.

［11］周春燕，冯作化.医学分子生物学［M］.北京：人民卫生出版社，2014：152-4.

［12］Okayama H.Cell cycle control by anchorage signaling［J］.Cell Signal，2012，24（8）：1599-609.

［13］Lange C A，Yee D.Killing the second messenger：targeting loss of cell cycle control in endocrine-resistant breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2011，18（4）：C19-24.

［14］Wang H，Chen X，Chen Y，et al.Antitumor activity ofnovel chimeric peptides derived from cyclinD／CDK4 and the protein transduction domain 4［J］.Amino Acids，2013，44（2）：499-510.

［15］Soprano D R，Qin P，Soprano K J.Retinoic acid receptors and cancers［J］.Annu Rev Nutr，2004，24：201-21.

Effects of a novel all-trans retinoid acid derivative 4-am ino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on the proliferation of HepG2 cells

Liu Hui，Zhou Qing，Wang Yuan
（Dept of Biochemistry and Laboratory of Molecular Biology，AnhuiMedical University；Dept of Key Laboratory，Gene Resource Utilization for Severe Disease of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To explore the effects of4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate（ATPR）on the proliferation of human hepatocellular carcinoma（HCC）HepG2 cells and preliminarily clarify the probable mechanisms. Methods HepG2 cells were used as the research model and treated with all-trans retinoic acid（ATRA）and ATPR respectively.The viability of HepG2 cells was investigated by MTT assay.Flow cytometry was used to detect cell cycle distribution.The expression of cyclinD，cyclin-dependent kinase 4（CDK4） and CDK6 proteins in HepG2 cellswere detected by Western blot.Results ATPR significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose-and time-dependentmanner compared with cell group and arrested cells on G0／G1phase（P＜0.05）. The inhibition rate of ATPR wasmuch higher than that of ATRA at the same dose for the indicated time（P＜0.05）.In addition，Western blot results showed that ATPR down regulated the expression of cyclinD and CDK6 more dramatically than ATRA（P＜0.05），while CDK4 expression was constant in all groups.Conclusion ATPR exhibits a better inhibitory effect on HepG2 cells proliferation than ATRA.The mechanism may be partly through down regulating the expression of cyclinD and CDK6 to cause G0／G1arrest，which finally leads to growth inhibition.

hepatocellular carcinoma；HepG2 cells；all-trans retinoic acid；4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate；cell cycle；cell proliferation

R 735.7；R 966；R 34

A

1000-1492（2016）02-0156-05

时间：2016-1-20 10：32：26

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.004.htm l

2015-11-17接收

国家自然科学基金（编号：81272399）；安徽省自然科学基金（编号：090413116）

安徽医科大学分子生物学实验室、生物化学与分子生物学

教研室、安徽省 ／省部共建教育部重要遗传病基因资源利用重点实验室，合肥 230032

刘 慧，女，硕士研究生；

汪 渊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：aydesm-1＠163.com