Id-1在结直肠腺癌、腺瘤、正常黏膜中的表达及意义

武雪亮，王立坤，薛 军，杨东东，屈 明，郭 飞，杨瑞敏，刘 博，候占富

Id-1在结直肠腺癌、腺瘤、正常黏膜中的表达及意义

武雪亮1，王立坤2，薛 军1，杨东东2，屈 明1，郭 飞1，杨瑞敏3，刘 博4，候占富5

目的研究 DNA结合分化抑制蛋白 1（Id-1）在结直肠癌细胞增殖、分化过程中的重要作用。方法选取手术切除腺瘤伴不典型增生 30例（中低度 16例、重度 14例）、腺癌50例、邻近正常黏膜 50例，通过免疫组化、荧光原位杂交方法检测其 Id-1的表达情况，并研究其与结直肠癌相关临床病理因素之间的关系。结果Id-1蛋白在结直肠正常黏膜、中低度不典型增生腺瘤、重度不典型增生腺瘤、腺癌中的阳性表 达 率 分 别 为 24.00%、31.25%、57.14%、72.00%；Id-1mRNA在结直肠正常黏膜、中低度不典型增生腺瘤、重度不典型增生 腺 瘤、腺 癌 中 的 阳 性 表 达 率 分 别 为 20.00%、25.00%、57.14%、76.00%；Id-1蛋白及 Id-1mRNA在正常黏膜组织、腺瘤伴中低度不典型增生、腺瘤伴重度不典型增生、腺癌中的阳性表达逐步增强（P＜0.01）；Kappa一致性检验显示，在正常黏膜、腺瘤、腺癌组织中吻合系数分别为 k= 0.791、0.729、0.905；从 TNM Ⅰ ～Ⅳ期 Id-1表达也逐渐增强，差异有统计学意义（P＜0.01）；Id-1表达与肿瘤浆膜浸润、CEA（+）、淋巴结转移、肝转移及脉管浸润等密切相关（P＜0.01），而与肿瘤大小及分化程度无关。结论Id-1异常表达在肿瘤癌变过程中发挥了重要作用，有望成为新的肿瘤监测指标，为临床诊治及预后判断指明新的方向。

结直肠癌；Id-1；免疫组化；原位杂交；临床意义

目前对结直肠癌的治疗仍以手术根治为主，但以早期治疗效果最佳，术后积极复查预防复发转移是关键［1-2］。因而寻找有效、特异性高的生物学指标对结直肠癌的早期诊断及术后防治有极其重要的价值。DNA结合分化抑制蛋白 1（inhibitors of DNA binding-1，Id-1）是近年来研究 较 热 的 一 种 致 癌 基因，能抑制细胞分化、加速有丝分裂、调控细胞周期、诱导血管生成、加速肿瘤生长并转移［3］，在乳腺癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤中均呈高表达［4-8］，但在结直肠癌方面研究较少。该实验通过对 Id-1行免疫组化染色、原位杂交分析，旨在探讨 Id-1在结直肠癌发生过程中的重要作用及与相关临床病理因素的联系，初步探讨其致癌机制。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集 2012年5月 ～2014年 5月河北北方学院附属第一医院血管腺体外科手术切除的原发性结直肠癌组织 50例、正常组织 50例、腺瘤伴不典型增生 30例（中低度 16例、重度 14例），癌组织取自癌灶中心处，另取标本残端切缘经病理证实为正常肠组织。术前未行新辅助放化疗等针对性治疗。

1.2 免疫组化方法及试剂兔抗人单克隆浓缩型Id-1抗体（克隆号 ab50932 R2-1G6）购于香港 Abcam公司；链霉素抗生物素蛋白 -过氧化酶（SP）、DAB试剂盒均购于美国 Abnova公司。10%甲醛溶液固定部分标本，并用石蜡包埋，对其进行免疫组化染色，同时收集全部制备好的蜡块并切片，切片厚度为 4μm。使用苏木精 -伊红（hematoxylin-esin，HE）染色方法，染色切片由高年资病理医师在光学显微镜下独立观察评估并做出病理诊断。切片置80℃烤箱烤片 30 min，乙醇脱水，灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液高温高压水化修复；PBS洗 3次，加一抗，4℃过夜；PBS洗 3次，加二抗。室温下DAB显色，根据显色情况控制显示时间，苏木精轻度复染，并用 1%的盐酸乙醇分化 5 min、流水冲 5 min、梯度乙醇脱水（80%、85%、90%、95%、100%、100%）及松节油透明 5 min，最后树胶封片。阴性对照为 PBS代替一抗。

1.3 原位杂交方法及试剂Id-1 mRNA原位杂交试剂盒购于香港 Abcam公司，其靶基因的 mRNA序列 为 F：5′-TCTACGACATGAACGGCTG-3′，R：5′-GGTCCCTGATGTAGTCGAT-3′。切片厚度为 4μm，脱蜡、水化；3%H2O2室温孵 15 min，灭活内源性过氧化酶，暴露 mRNA核酸片段。滴加 3%稀释胃蛋白酶（1 ml 3%柠檬酸：2滴浓缩型胃蛋白酶），37℃消化，PBS冲洗，预杂交；滴加 15μl预杂交液，置恒温箱 42℃过夜；SSC洗涤 5 min；滴加封闭液；37℃30 min。PBS冲洗，滴加生物素化鼠地高辛一抗-SABC-生物素化过氧化物酶：37℃ 20 min。DAB显色，显色 20 min，充分水洗，苏木精轻度复染，最后树胶封片。

1.4 阳性结果的判定标准Id-1阳性表达的判定：细胞浆中染有棕黄色，褐色颗粒。计算阳性细胞百分比评分：≤5%为 0分，6% ～25%为 1分，26% ～50%为 2分，51% ～75%为 3分，＞75%为 4分；无着色：0分，浅黄色：1分，黄色：2分，深黄色：3分。两者相乘，0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（⧺），9～1 2分为（⧻），（+）～（⧻）均视为阳性。

1.5 统计学处理应用 SPSS 17.0统计软件进行分析，计数资料以百分率表示，采用 χ2检验和 Fisher精确概率法，设检验水平 α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠正常黏膜、腺瘤、腺癌组织中Id-1蛋白表达的情况结直肠癌组织中 Id-1的阳性表达率为 72.00%（36／50），腺瘤伴中低度不典型增生、腺瘤伴高度不典型增生组织中 Id-1的阳性表达率分别是 31.25%（5／16）和 57.14%（8／14），而在正常组织中阳性表达率为是 24.00%（12／50）。Id-1在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生组织中的阳性率明显低于腺瘤伴重度不典型增生组织及腺癌组织（P＜0.01）；而 Id-1在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生组织中的阳性率则差异不大；Id-1在腺瘤伴重度不典型增生组织及腺癌组织组织中的阳性率则亦无明显变化。见图1、表 1。

2.2 结直肠正常黏膜、腺瘤、腺癌组织中Id-1 m RNA表达的情况50例结直肠癌组织中 Id-1 mRNA的阳性表达率为 76.00%（38／50），稍高于 Id-1蛋白表达；16例腺瘤伴中低度不典型增生、14例腺瘤伴高度不典型增生组织中 Id-1mRNA的阳性表达率分别是 25.00%（4／16）和 57.14%（8／14），而在 50例正常组织中阳性表达率为是 20.00%（10／50），稍低于 Id-1蛋白表达；Id-1mRNA在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生组织中的阳性率明显低于腺瘤伴重度不典型增生组织及腺癌组织（P＜0.01）；而 Id-1mRNA在正常黏膜、腺瘤伴中低度不典型增生组织中的阳性率则差异不大；Id-1mRNA在腺瘤伴重度不典型增生组织及腺癌组织组织中的阳性率则亦无明显变化，与 Id-1蛋白表达基本一致，见图1、表 2。

表1 Id-1蛋白在结直肠正常组织、腺瘤及腺癌组织中的表达

图1 Id-1在结直肠正常组织、腺瘤及结直肠癌组织中的表达 ×400 1：IHC；2：ISH；A：结直肠正常组织；B：腺瘤；C：结直肠癌组织

表2 Id-1mRNA在结直肠正常组织、腺瘤及腺癌组织中的表达

2.3 两种检测方法检测Id-1和Id-1m RNA的结果对比分析运用 Kappa检验两种方法检测的一致性，在正常黏膜组织中，吻合系数为 0.791，腺瘤组织中吻合系数为 0.729；腺癌组织中，吻合系数为0.905。

2.4 结直肠癌组织中Id-1和临床病理参数之间的相关性Id-1蛋白的表达水平与患者肿瘤大小、分化程度等临床病理参数无关，而是与肿瘤浆膜浸润、肝转移、淋巴结转移、肿瘤 TNM分期、脉管浸润和CEA（+）密切相关（P＜0.01），见表 3。

3 讨论

Id-1是 1995年发现的一种分化抑制因子，最初的小鼠实验发现其可促进细胞增殖、诱导肿瘤血管生成、促进肿瘤的生长及侵袭［9］。Id-1定位于染色体 6p21-22上，广泛表达于哺乳动物的胚胎、生殖腺体及一些分化不成熟的组织细胞中。Id-1系螺旋 -环 -螺旋（helix-loop-helix，HLH）转录因子家族重要成员，是细胞分化的负性调控因子。HLH区高度保守，包含2个 α螺旋，由15～20个残基组成，这两条α螺旋被一个多序列、多长度环区分割开来，广泛表达于各生物体［10-11］。大多数 HLH结构存在一个碱性 HLH（bHLH）因子与其紧密相邻，二者相互结合形成异质二聚体，其中两个碱性区与目标 DNA结合，诱导启动子中的 E-盒样结构的靶基因转录并整合成所谓的“E-box”DNA序列，从而调控细胞增殖分化。Id-1无碱性结构域，因而与 bHLH因子结合生成的二聚体无转录功能，无法与目标 DNA序列结合，从而抑制细胞分化［12］。研究［13］证实，Id-1基因在细胞增殖期表达上调，分化期表达下降。Cheung et al［14］研 究 报 道 Id-1表 达 上 调 能 激 活 Raf-1及MAPK激酶信号传导途径，抑制细胞凋亡，参与肿瘤发生发展。Lee et al［15］发现 Id-1还可通过磷酸化抑制 Rb途径并阻断 p16（INK4a）表达，从而促进 G1、G2、S、M期细胞增殖增加目标 DNA合成；Id-1的高异常表达可激活 VEGF及其受体体，以释放促血管生成的自分泌信号，诱导形成新生的肿瘤血管内皮细胞，从而促进肿瘤的发生进展。Sharma et al［16］发现，Id-1可直接或间接抑制血小板凝血酶敏感蛋白-1即血栓收缩蛋白-1，来调节血管的生成。

表3 Id-1在结直肠癌组织中的表达与相关临床病理指标的关系

本研究表明，Id-1mRNA及蛋白在正常黏膜组织、腺瘤、腺癌中的阳性表达逐步增强，且在结直肠腺癌中的阳性率远高于腺瘤伴中低度不典型增生及正常黏膜组织，提示 Id-1表达的异常上调是正常黏膜-癌前病变-腺癌这一癌变过程中的早期分子学事件，即在癌变的早期阶段 Id-1即被激活，这与叶英海 等［17］研究结果一致。进一步研究表明 Id-1与结直肠肿瘤的浆膜浸润、肝转移、淋巴结转移、TNM分期、脉管浸润等密切相关，表明 Id-1在结直肠癌组织中的高表达，不仅与结直肠腺癌的发生进展有关，而且与肿瘤的浸润和侵袭相关。因而 Id-1有望成为新的肿瘤监测指标，为临床诊治及预后判断提供重要的参考。

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Expressions of Id-1 in colorectal adenocarcinom a tissues，adenoma tissues，and normal colorectal tissues

Wu Xueliang1，Wang Likun2，Xue Jun1，et al
（1Dept of Vascular Gland Surgery，2Dept of Ultrasound，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000）

Objective To study the expression of Id-1 in human colorectal adenocarcinoma tissues and explore its correlation with the initiation and progression of colorectal cancer.Methods The expression of Id-1 in 50 specimens of normal colorectal tissues，50 specimens of colorectal adenomacarcinoma tissues，and 30 colorectal adenoma tissues（moderate-low dysplasia of16 cases and high dysplasia of 14 cases）were detected using immunohistochemistry technique and in situ hybridization.The correlation between its expression and the elinieopathologie features was analyzed.Results The positive expression rates of Id-1 protein in colorectal normal tissues，colorectal adenoma tissueswith moderate-low dysplasia，colorectal adenoma tissueswith high dysplasia，and colorectal adenocarcinoma tissues，were 24.00%，31.25%，57.14%，and 72.00%.The positive rates of Id-1mRNA in colorectal normalti-ssues，colorectal adenocarcinoma tissues with moderate-low dysplasia，colorectal adenocarcinoma tissues with high dysplasia，and colorectal adenocarcinoma tissues，were 20.00%，25.00%，57.14%，and 76.00%.The positive expression rates of Id-1 protein and Id-1mRNA in colorectal normal tissues，colorectal adenocarcinoma tissues with moderate-low dysplasia，colorectal adenocarcinoma tissues with high dysplasia，and colorectal adenocarcinoma tissues gradually increased and the differences had obvious statistical significance（P＜0.01）.The coincidence coefficient in normal colorectal tissues，adenoma tissues，and colorectal adenocarcinoma tissues were 0.791，0.729，and 0.905 by Kappa testing.The positive expression level from TNMI to TNMIV stage in colorectal adenocarcinoma tissues increased gradually，and there was statistical significance（P＜0.01）.Expression of Id-1 was correlated with the depth of tumor invasion，CEA（+），lymph nodemetastasis，vessel invasion，and livermetastasis（P＜0.01），but notwith the patient’s tumor size，and differentiation degrees.Conclusion The abnormal expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues plays an important role in the process of cancer，and is expected to become the new tumormonitoring indicators，which indicates the new direction for clinical diagnosis and treatment and prognosis judgement.

colorectal neoplasms；Id-1；immunohistochemistry；in situ hybridizationi；clinical significance

R 735.37；R 735.35

A

1000-1492（2016）02-0297-05

时间：2016-1-20 10：32：27

http：／／www.cnki.net／kcms／detail／34.1065.R.20160120.1032.068.htm l

2015-11-17接收

河北省医学科学研究重点课题计划（编号：20150058）；张家口市科技局指令性计划（编号：1311055D）

河北北方学院附属第一医院1血管腺体外科、2胃肠外

科、3超声医学科、4病理科、5河北省张家口市宣化中医院普外科，张家口 075000

武雪亮，男，主治医师，硕士；薛 军，男，主 任 医 师，硕 士 生 导 师，责 任 作 者，E-mail：yfyxuejun＠163.com