马氏珠母贝肌肉生长抑制素基因eSNP多态性与生长性状的关联分析

黄　文，李琴，林坚士，何毛贤

（1.中国科学院南海海洋研究所　中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室　广东省应用海洋生物学重点实验室，广东　广州　510301；2.中国科学院大学，北京　100039）



马氏珠母贝肌肉生长抑制素基因eSNP多态性与生长性状的关联分析

黄文1，2，李琴1，2，林坚士1，何毛贤1

（1.中国科学院南海海洋研究所中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室广东省应用海洋生物学重点实验室，广东广州510301；2.中国科学院大学，北京100039）

摘要：肌肉生长抑制素myostatin（MSTN），是目前已知抑制肌肉生长最强效的分化因子，具有负向调控肌肉生长、发育的作用，它与生长之间的这种单向作用关系，使其在养殖生物遗传改良上具有重要的潜在应用价值。文以马氏珠母贝MSTN基因21个eSNP位点作为候选SNP位点，对106只马氏珠母贝进行基因分型并与8个生长性状进行关联分析。SNP最小等位基因频率的范围为0.028 3～0.490 4，多态信息含量（PIC）的范围为0.093 6～0.375 0，观测杂合度（Ho）及期望杂合度（He）的范围分别为0.028 3～1.000 0及0.098 9～0.502 7。2个SNP位点与生长性状显著关联：g.3154 A>G位点的GG型个体的壳高、壳长、总重、壳重、软体部重和闭壳肌重显著大于AG型个体（P<0.05）；g.4379A>G位点GG型个体的壳高、壳长、铰合线长、总重、软体部重和闭壳肌重显著大于AG型个体（P<0.05）。g.3154 A>G位点和g.4379A>G位点间无显著交互作用。这2个SNP可作为潜在的马氏珠母贝基因型选择育种标记。

关键词：马氏珠母贝；肌肉生长抑制素MSTN；单核苷酸多态性；生长性状；关联分析

目前在水产动物育种领域，研究生长性状相关基因主要有两种方法：基因组测序筛选检测或称QTL定位法和候选基因法（candidate gene approach）。其中，候选基因法因具有目标明确，检验效率高，且有费用低廉、对群体要求较低、操作简便等优点，广泛应用在研究性状关联分子标记中，如W ang等（2012）通过对MDA5（黑色素瘤分化相关基因-5）的5’侧翼区中的SNP与草鱼对GCRV疾病的易感性/抗性进行关联分析，确定了与抗性相关的草鱼（Ctenopharyngodon idella）的基因型，魏可鹏等（2012）克隆了建鲤（Cyprinus carpio）IGFBP1基因，并成功筛选到了两个与增重显著相关的SNPs位点。

肌肉生长抑制素myostatin（MSTN），是目前已知抑制肌肉生长最强效的分化因子，具有负向调控肌肉生长、发育的作用，它与生长之间的这种单向作用关系，使其在养殖生物遗传改良上具有重要的潜在应用价值。近年来，myostatin基因及其SNP与多种经济性状之间的显著关联已在鸡（Gallus domesticus）（McFarland et al，2007）、马（Equus caballus）（Li et al，2014）、大口黑鲈（Micropterus salmoide）（于凌云等，2010）和扇贝（Chlamys farreri；Argopecten irradians）（Hu et al，2010；Guo et al，2012）等多个物种中被鉴定，而这种关联性可以为日后开展分子标记辅助育种奠定基础。

马氏珠母贝（Pinctada fucata）是一种重要的海水养殖贝类，利用分子标记辅助育种可加快马氏珠母贝育种进程。本研究中以马氏珠母贝myostatin基因作为生长性状相关的候选基因，检测基因外显子上的SNP位点（eSNP），并对其基因型与生长性状进行关联分析，同时分析了SNP位点间的聚合效应，以期为马氏珠母贝分子标记辅助育种提供潜在的SNP标记。

1材料与方法

1.1实验样品

本实验所用的马氏珠母贝（Pinctada fucata）来源于以生长性状为选择指标的混合选择群体第三代，其基础群体为深圳野生群体，养殖于深圳大鹏澳海区。随机从该群体（8月龄）中取106只贝，测量并记录每只贝的壳高、壳长、铰合线长、壳宽、总重、壳重、软体部重和闭壳肌重，其均值分别为48.45±6.13 mm、46.72±5.92 mm、40.48± 4.39mm、17.28±1.90mm、17.04±5.18 g、9.71± 2.79 g、5.15±1.97 g、0.83±0.39 g。取每只贝的闭壳肌组织于95％乙醇中，-20°C保存。

1.2基因组DNA的提取

使用HiPure Universal DNA Mini Kit提取闭壳肌组织的DNA，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计测量DNA样品A260/ A280的比值来检测纯度，提取的DNA于-20°C保存。

1.3 SNP位点分型

用于分型用的21个外显子SNP（eSNP）位点来源于Li等（2014）鉴定的马氏珠母贝MSTN基因，并根据其在基因组DNA的位置重新命名。利用Tetra-Primer Arms在线引物设计程序（http：// primer1.soton.ac.uk/primer1.html）设计SNP位点的基因分型引物（表1）。Tetra-Primer PCR分型引物包括两条内引物FI、RI及两条外引物FO、RO，其中两条内引物3'端倒数第三个碱基引入一个错配碱基以增加特异性。当检测样品为杂合型时电泳结果理论上应该有三条带，包括两条外引物扩增的一条带（FI、RI），内引物和外引物扩增的两条带（FI、RO）以及（RI、FO）；当检测样品为纯合型时则为两条带，包括两条外引物扩增的一条带（FI、RI），内引物与外引物扩增条带中的一条。PCR反应体系为：2×PCR Mix 2.0μL，DNA Taq酶0.125μL，引物（10μM）0.5μL，基因组DNA 0.4μL，ddH2O 3.725μL；扩增程序为：94℃预变性4min，1个循环；94°C变性35 s，最适退火温度退火40 s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min，1个循环。PCR产物用3.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，观察电泳图谱（图1），确定每个个体的基因型。

1.4 SNP与生长性状的关联分析

统计群体中SNP碱基置换类型及各种类型的数量。利用PIC_CALC软件计算群体中每个SNP位点的多态信息含量（polymorphism content information，PIC）。利用Popgene软件（Yeh etal，1997）计算每个SNP位点在群体中的等位基因频率、基因型频率、有效等位基因数（Ne）、期望杂合度（expected heterozygosity，He）和观测杂合度（observed heterozygosity，Ho），并进行哈德-温伯格平衡（Hardy-W einberg equilibrium，HW E）检验，SHEsis软件分析连锁不平衡。由于总体分布未知，因此对于106只贝生长性状正态分布进行检验，采用非参数检验中的单样本Kolmogorov-Smirnov检验，计算结果显示8个性状的P值均大于0.05，即符合正态分布。采用SPSS 17.0软件中的GLM程序对21个SNP位点与各生长性状进行关联分析，得到显著关联生长的SNP位点（P<0.05），并检验两位点间是否存在交互作用；对于显著关联生长性状SNP位点经Levene检验结果P值均大于0.05，表明方差齐次，然后采用Sidak法比较g.3154A>G位点不同基因型间的性状差异，对于g.4379A>G位点采用独立样本t检验比较（P<0.05）。

表1　21个SNP位点分型引物

续表1　21个SNP位点分型引物

图1　部分个体在位点SNP g.2923C>T的分型结果（1.GenStar direct-loadTM 100bp DNA LadderMarker；2-13：每个个体的基因型，CC表示纯合子，CT表示杂合子）

2实验结果

2.1 21个SNP位点的遗传参数统计

在这21个SNP位点中，最常见的突变类型为A/G转换，共有8个位点属于此类，占SNP位点总数的38.1％；其次为G/T颠换和C/T转换，各包括5个SNP位点，分别占位点总数的23.8％。除g.3222A >G、g.4595C>T检测到一种基因型，g.4379A>G、g.12648C>T检测到两种基因型，其他位点3种基因型均能检出。群体中最小等位基因频率（minorallele frequency，MAF）的范围为0.0519～ 0.500 0，多态信息含量（PIC）的范围为0.093 6～ 0.375 0，观测杂合度（Ho）及期望杂合度（He）的范围分别为0.028 3～1.000 0及0.098 9～0.502 7（表2）。哈德-温伯格平衡（HW E）检验结果表明，21个SNP中有8个符合平衡（表3）。

2.2 SNP与生长性状的关联分析及均值比较分析

经GLM分析，在这21个SNP位点中，只有g.3154A>G、g.4379A>G这2个位点与生长性状显著相关（P<0.05）（表4-5）。进一步分析表明，对于g.3154A>G位点，GG型个体的壳高、壳长、总重、壳重、软体部重和闭壳肌重显著大于AG型个体（P<0.05），分别大10.99％、9.08％、26.12％、26.65％、35.28％和43.33％，AA型个体除壳宽显著大于AG型个体（P<0.05），其他性状均与另外两种基因型无显著差异；g.4379A>G位点，GG型个体的壳高、壳长、铰合线长、总重、软体部重和闭壳肌重显著大于AG型个体（P<0.05），分别大6.20％、6.96％、5.65％、13.58％、18.01％、27.40％（表6）。

对两个与软体部重和闭壳肌重都显著关联的位点（g.3154A >G位点和g.4379A >G）用SHEsis软件连锁不平衡分析，表明这两个位点连锁不紧密（D＇= 0.26和R2= 0.04），用GLM做两因素交互分析，未发现两位点存在显著交互作用（表7）。

表2　马氏珠母贝M STN基因21个eSNP位点的基因型频率及等位基因频率

表3　马氏珠母贝M STN 21个eSNP位点的群体遗传参数

表4　g.3154A>G位点与生长性状的关联性分析

表5　g.4379A>G位点与生长性状的关联性分析

表6　两个显著关联生长性状的SNP位点的均值比较分析

表7　g.3154A>G位点和g.4379A>G位点交互作用分析

3讨论

有研究表明SNP位点在不同群体中，分布情况具有差异性。Morales-Colli＇o等（2014）在野生群体和养殖群体中对紫扇贝（Argopecten purpuratus）基因上的三个SNP位点进行分型，结果发现，一个位于5’-UTR的SNP和一个位于编码区的SNP均只出现在野生群体中，另一个位于3＇-UTR 的SNP却只出现在养殖群体中。Sauvage等（2007）在太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中发现编码区每60个碱基有一个SNP位点，而非编码区每40个碱基就有一个，表明非编码区还存在大量SNP位点。而在本实验中，我们用于分型的群体仅来自于一个混合选择群体，属于人工选育群体；且SNP位点全部来自外显子区域，这些可能是导致部分SNP位点基因型未被全部检出的主要原因。

在马氏珠母贝MSTN的外显子中，检测出21个多态SNP位点，明显高于Guo等（2011）在海湾扇贝（Argopecten irradians）MSTN基因外显子上确定的两个SNP位点，而Núñez-Acuña等（2014）则在贻贝（Mytilus chilensis）中检测到37个SNP位点，说明该基因的多态性水平存在物种间差异。将这21个SNPs的遗传参数，如观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He），与Huang等（2014）获得的马氏珠母贝SNPs结果比较，发现其杂合度和期望杂合度较其高，说明马氏珠母贝MSTN基因外显子碱基变异水平较高。

为了探索这些SNP与性状之间是否存在某些关联性，对SNP基因型和表型进行了统计学分析。GLM程序分析结果显示21个SNP位点中有两个位点与某些生长性状显著关联。从统计结果上看，g.3154A>G位点GG型个体的壳高、壳长、总重、壳重、软体部重及闭壳肌重大于AG型基因型个体；g.4379A>G位点GG型个体的壳高、壳长、绞合线长、总重、软体部重及闭壳肌重大于AG型基因型个体。对于这两个SNP位点，GG型都为优异基因型。同时，这两个位点与马氏珠母贝的软体部重及闭壳肌重显著关联，因而这两个位点可能与myostatin基因的表达密切相关。根据前面的分析，GG型为优异基因型，我们推测GG型个体myostatin基因的表达较其他基因型个体较低。类似的研究在扇贝中也有报道，如W ang等（2010）对栉孔扇贝（Chlamys farreri）基因编码区的SNP进行鉴定，并将其基因型与生长性状进行关联分析，发现Cf-MSTN存在两个SNPs，分别位于外显子2 和3上，外显子2上的SNP的GG基因型个体在体重、软体部重、闭壳肌重、壳长、壳高各项生长指标上也均优于基因型AA和AG的个体，同时还发现1个SNP位点会引起氨基酸变化。在本研究中，g.3154A>G位点和g.4379A>G位点虽位于Pf-MSTN cDNA的开放阅读框内，但不会引起氨基酸的改变，属于同义突变。然而，近年来很多研究表明，同义突变也能调控基因的转录和翻译，Greenwood等（2003）发现启动子和内含子同义突变均能够影响许多基因的转录效率，Kimchi-Sarfaty等（2007）发现MDR1基因中的一个同义突变可以改变蛋白的空间结构；Capon等（2004）发现角膜锁链蛋白基因中的同义突变能提高mRNA分子的稳定性。因此，将来对这类SNP继续进行深入研究很有必要，这有助于阐明myostatin基因变异对马氏珠母贝生长性状的影响。

优异基因的聚合能得到理想的累加效应，基因聚合最早由Yadav等（1990）研究改良芥菜（Brassica juncea）抗逆和抗病性状时提出。目前，基因聚合效应已经广泛应用在研究农作物和禽畜的经济性状中，而在水产育种方面报道较少。束婧婷（2007）统计不同品种鸡（Gallus domesticus）ADSL和ARS-AIRS-GART基因的多态性，并分析不同基因型组合对胸肌IMP（肌苷酸）含量的影响，结果表明，TTTT组合基因型个体的IMP含量显著高于CCCC型个体（P<0.05）。陈磊（2013）研究了大黑口鲈（Micropterus salmoide）8个分子标记的基因聚合效应，发现随着优异基因型数量的增加，平均体重同步递增，而位于MSTN上的优异基因型对体重的贡献率最大。基因型的聚合效应并不是各基因型效应所造成的表型的简单相加，而且纯合基因型互相组合具有显著的累加效应，能够稳定的遗传给子代。在本研究中，g.3154A>G位点和g.4379A>G位点并不存在交互作用，GGGG型个体在软体部重和闭壳肌重具有最大均值，但较其它基因型组合差异并不显著，因而这两个优异基因型不存在明显聚合效应。

虽然未检测到聚合效应，但在本研究中筛选到的显著关联的SNP位点仍可作为马氏珠母贝基因型选择育种的潜在分子标记，这些标记的育种效应将在后续的研究中加以验证。

参考文献

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（本文编辑：袁泽轶）

Singlenucleotide polym orphism sofm yostatin geneand itsassociation w ith grow th traits in the pearloyster,Pinctada fucata

HUANG W en1,2,LIQin1,2,LIN Jian-shi1,HE Mao-xian1
（1.CASKey LaboratoryofTropicalMarine Bio-resourcesand Ecology,Guangdong ProvincialKey LaboratoryofApplied Marine Biology,South China Sea InstituteofOceanology,Chinese AcademyofSciences,Guangzhou 510301,China;2.UniversityofChineseAcademyof Sciences,Beijing100049,China）

Abstract：Myostatin (MSTN),known as themostpowerfulgrowth differentiation factor,playsa crucial role in the negative regulation ofmuscle growth and development.The existence ofa single genewith such amajor effecton themuscle growth makes ithave the potentialvalue in the genetic improvementofanimals.In thisstudy,we used 21 eSNPs from myostatin gene to divide the genotypes of 106 individuals from a breeding stock of pearl oyster Pinctada fucata and made the correlation analysiswith the eightgrowth traits.The results show that theminorallele frequency (MAF) and polymorphism information content(PIC) are in the range of0.028 3 to 0.490 4 and 0.093 6 to 0.375 0,and the observed and expected heterozygosities range from 0.028 3 to 1.000 and 0.098 9 to 0.502 7,respectively.Two SNPsare significantly associated with growth traits:for the g.3154A>G site,individualswith GG type are significantly greater than thosewith AG type in the shellheight,shell length,totalweight,shellweight,soft tissueweightand adductormuscleweight(P<0.05);for the g.4379A>G site,oneswith GG type are significantly greater than thosewith AG type in the shellheight,shell length,hinge line length,totalweight,soft tissue weight and adductormuscle weight(P<0.05) .There is no significant interaction between g.3154A>G site and g.book=89,ebook=924379A>G site.These two SNPs could be used as the potentialmolecularmarkers in the genotype-selective breeding for P.fucata.

Keywords：Pinctada fucata;myostatin;single-nucleotide polymorphism;growth traits;association analysis

通讯作者：何毛贤，研究员，电子邮箱：hmx@scsio.ac.cn。

作者简介：黄文，男，硕士研究生，主要从事马氏珠母贝分子遗传育种研究，电子邮箱：94214460@qq.com。

基金项目：国家863计划（2012AA10A410）；广东省科技计划项目（2013B020308005）。

收稿日期：2015-01-30；

修订日期：2015-03-19

Doi：10.11840/j.issn.1001-6392.2016.01.012

中图分类号：S968.31

文献标识码：A

文章编号：1001-6932（2016）01-0088-08