人参皂苷Rg1减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的作用研究

陈海霞　黄广丽　周红瀛　石庆生



人参皂苷Rg1减轻大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的作用研究

陈海霞黄广丽周红瀛石庆生

【摘要】目的探讨人参皂苷Rg1对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的减轻作用及机制。方法制备大鼠离体心脏I/R模型，将18只大鼠随机分为正常对照组、I/R组、人参皂苷Rg1组。100 μmol/L人参皂苷Rg1进行预处理10 min，观察血流动力学指标左心室内压最大上升/下降速率和心率压力乘积的变化，检测灌流液中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性。Western blotting检测心肌组织PI3K下游激酶Akt、ERK1/2及其磷酸化水平的变化，磷酸化GSK-3β的蛋白表达。结果与I/R组比较，人参皂苷Rg1预处理显著改善心脏功能，降低灌流液中CK、LDH活性(P＜0.05) ;升高p-Akt和p-GSK-3β的蛋白表达(P＜0.05)。结论人参皂苷Rg1对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤有减轻作用，其机制与激活PI3K-Akt通路有关。

【关键词】人参皂苷Rg1;大鼠离体心脏;血流动力学指标;肌酸激酶;乳酸脱氢酶

近年来，病毒性心肌炎、心肌梗死发病率逐年升高，现已成为目前常见的心血管疾病。病毒感染可引起心肌细胞的变性和坏死，继发免疫损伤，同时心肌纤维连接蛋白合成增加，降解减少，成纤维细胞产生细胞外基质，最终导致间质纤维化。研究表明，人参有心肌保护作用，人参皂苷为其主要药效成分，人参皂苷Rg1是人参皂苷的重要组分，能显著改善心肌缺血状态，减少缺血再灌注心肌细胞凋亡，改善心肌的舒缩功能，对心肌炎症或缺血等损伤有明显的保护作用［1］。本研究探讨人参皂苷Rg1对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的减轻作用及机制，报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物健康雄性SD大鼠，18只，体重300～ 340 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证编号: SCXK(京) 2009-0004。

1.2主要试剂与仪器

1.2.1药物与试剂:人参皂苷Rg1对照品，天津一方科技有限公司，纯度＞98%，Rg1分子量801.01，6.25、25、100 μmol/L相当于0.005、0.02、0.08 mg/ml。CK、LDH试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司;蛋白裂解液、GAPDH抗体，Saierbio Technology Incorporation; PKB/Akt、p-PKB/Akt(Ser-473)、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser-9)抗体，Cell Signaling Technology，Inc。Krebs-Henseleit(K-H)缓冲液(mmol/L)配制: NaCl 118、NaHCO324.0、KCl 4.7、MgSO41.2、KH2PO41.2、Glucose 11.1、CaCl22.5，pH值7.2～7.4。

1.2.2实验仪器: Langendorff离体心脏灌流系统，澳大利亚ADInstrument Pty Ltd;日立7020全自动生化分析仪，日本HITACHI公司; ORION 8102BNUWP型PH计，美国Thermo公司; miliq INTERGRD5超纯水系统，美国millipore; UC750超声波破碎仪，美国SONICS公司;蛋白电泳转印系统、proteanplus multi-ge多板制胶机，BIO-RAD。

1.3实验方法

1.3.1大鼠离体心脏的制备:麻醉大鼠后，迅速开胸取心脏置于预冷的K-H缓冲液中，主动脉固定于一插管上，后悬挂于Langendorff心脏灌流装置，用K-H缓冲液以65 mm Hg恒压逆行灌流。37℃恒温保存灌流液及心脏，将头端带有含水球囊的导管经二尖瓣口插入左心室，导管另一端连接压力感受器，实时监测并计算心脏功能参数。

1.3.2实验分组及流程:按体重随机区组法将大鼠分为3组，每组6只，采用全心停灌再灌注的方法建立离体心脏缺血再灌注模型，全心停灌40 min，复灌60 min以评价血流动力学、酶学指标(CK、LDH)。实验分组如下:①正常对照组(control组) :心脏用K-H缓冲液持续灌流130 min (血流动力学、TTC染色等)或80 min(Western blotting检测)。②I/R组:心脏平衡30 min后，全心停止灌流40 min，复灌60 min作为缺血再灌注对照组，即I/R组。③人参皂苷Rg1 (100 μmol/L)组(IR+ Rg1组) :心脏平衡20 min后，用含终浓度100 μmol/L人参皂苷Rg1(剂量参考相关文献［1，2］)的K-H缓冲液灌流心脏10 min，K-H缓冲液灌流冲洗后，全心停止灌流40 min，复灌60 min。全心停灌40 min，复灌10 min，用以Western blotting检测。停止灌流期间，心脏用37℃K-H缓冲液恒温浸泡。

1.3.3心脏功能的测定:全程监测离体心脏血流动力学参数。LVDP=LVSP-LVEDP; RPP=LVDP * HR;［RPP、±dp/dtmax］恢复率(%)=某时间点［RPP、±dp/dtmax］值×100%/基础水平［RPP、±dp/dtmax］值。

1.3.4心脏流出液CK、LDH活性的测定:分别在心脏灌注平衡20 min，再灌注10、20、30、60 min收集冠脉流出液，即时用全自动生化分析仪及相应试剂盒测定CK、LDH活性。

1.3.5Western blotting检测心肌组织蛋白表达:将心肌组织剪碎研磨，加细胞裂解液，低温离心取上清液。100 ml/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，将蛋白电转移至PVDF膜上。滴加含50 g/L脱脂乳的TBST封闭缓冲液中封闭后，依次滴加相应抗体，4℃孵育过夜，加相应二抗，37℃孵育2 h，显色后底片行数码拍摄，并用ImageJ 1.37软件进行半定量灰度分析。

2　结果

2.1人参皂苷Rg1对I/R大鼠离体心脏血流动力学的影响

2.1.1心率压力乘积RPP的恢复率:心率压力乘积RPP是反映心脏收缩功能的重要指标，大鼠心脏40 min缺血后，再灌注RPP恢复最高点及60 min时，I/R组RPP恢复率显著降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。再灌注RPP恢复最高点及60 min时，人参皂苷Rg1组RPP恢复率显著升高，与I/R组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明100 μmol/L人参皂苷Rg1能显著改善缺血再灌注造成的心脏收缩功能降低。见表1。

表1　人参皂苷Rg1对I/R大鼠离体心脏RPP恢复率的影响n=6，±s

表1　人参皂苷Rg1对I/R大鼠离体心脏RPP恢复率的影响n=6，±s

注:与control组比较，*P＜0.01;与I/R组比较，#P＜0.05; RPP的恢复率(%，该时间点RPP×100%/给药前RPP值)

组别　剂量(μmol/L) RPP恢复率(%) Peak value　60 min control组　－77.6±15.5　74.1±12.5 I/R组　－　14.05±6.92*　6.85±3.66*I/R+ Rg1组　100　49.89±27.19#　26.12±15.76#

2.1.2左心室内压最大上升速率(+ dp/dtmax)、左心室内压最大下降速率(－dp/dtmax)大鼠心脏缺血40 min后，再灌注+ dp/dt或－dp/dt恢复最高点及60 min时，I/R组左心室内压最大上升/下降速率恢复率显著降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。再灌注+ dp/dt或－dp/dt恢复最高点及60 min时，人参皂苷Rg1组左心室内压最大上升/下降速率及其变化率均显著升高，与I/R组比较，有统计学差异(P＜0.05)。见表2。

表2　人参皂苷Rg1对I/R大鼠+ dp/dt、－dp/dt恢复率的影响n=6，±s

表2　人参皂苷Rg1对I/R大鼠+ dp/dt、－dp/dt恢复率的影响n=6，±s

注:与control组比较，*P＜0.01;与I/R组比较，#P＜0.05; RPP的恢复率(%) :该时间点RPP×100%/给药前RPP值

组别　剂量(μmol/L)+ dp/dt恢复率(%) Peak value　60 min －dp/dt恢复率(%) Peak value　60 min control组　－　89.0±10.0　86.0±8.3　89.5±13.7　82.8±13.3 I/R组　－　10.93±7.85*　6.30±4.35* 17.14±9.99*　9.90±5.63* I/R+ Rg1组　100　21.66±3.46#　20.64±2.87# 55.62±31.65# 35.56±29.49#

2.2人参皂苷Rg1对I/R大鼠离体心脏冠脉流出液中CK、LDH的影响再灌注10、30、60 min时，100 μmol/L人参皂苷Rg1组CK、LDH释放量比I/R组著降低(P＜0.05)。见表3、4。

2.3离体心脏心肌组织Akt、ERK1/2、GSK-3β及其磷酸化的蛋白表达Western blotting结果显示，各组Akt、ERK1/2、GSK-3β蛋白表达无显著差异(数据未列出)。与control组比较，I/R组p-Akt(Ser-473)/Akt升高;人参皂苷Rg1预处理后p-Akt(Ser-473)/Akt显著升高，与I/R组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示人参皂苷Rg1能上调p-Akt蛋白表达。人参皂苷Rg1预处理后，p-GSK-3β(Ser-9)/GSK-3β比I/R组升高，提示人参皂苷Rg1能上调p-GSK-3β蛋白表达。见表5，图1。

表3　人参皂苷Rg1对IR大鼠LDH释放的影响n=6，U/L±s

表3　人参皂苷Rg1对IR大鼠LDH释放的影响n=6，U/L±s

注:与I/R组比较，*P＜0.05

组别　剂量(μmol/L)释放10 min　30 min　60 min I/R组　－　87.07±29.58　78.86±24.49　79.92±25.46 I/R+ Rg1组　100　48.09±22.08*47.18±21.06*59.96±21.51*

表4　人参皂苷Rg1对IR大鼠CK释放的影响n=6，U/L±s

表4　人参皂苷Rg1对IR大鼠CK释放的影响n=6，U/L±s

注:与I/R组比较，*P＜0.05

组别　剂量(μmol/L)释放10 min　30 min　60 min I/R组　－　288.21±15.58 265.69±17.93 271.39±13.08 I/R+ Rg1组　100　191.57±8.67*220.03±4.03*239.65±19.38

表5　大鼠离体心脏p-Akt(Ser-473)/Akt、p-GSK-3β(Ser-9)/GSK-3β、p-ERK1/2/ERK1/2表达　n=3，±s

表5　大鼠离体心脏p-Akt(Ser-473)/Akt、p-GSK-3β(Ser-9)/GSK-3β、p-ERK1/2/ERK1/2表达　n=3，±s

注:与control组比较，*P＜0.01;与I/R组比较，#P＜0.05

组别　p-Akt/Akt　p-GSK-3β/GSK-3βp-ERK1/2/ERK1/2 control组0.13±0.04　0.13±0.03　0.09±0.02 I/R组　0.66±0.14*　1.08±0.22*　0.10±0.02 Rg1组　1.23±0.32#　1.96±0.61#0.10±0.03

图1　离体大鼠心脏Akt、GSK-3β、ERK1/2及其磷酸化的蛋白表达

1、5: control组;2、6: I/R组; 3、7:人参皂苷Rb1 100 μmol/L组(与本实验无关) ;4、8:人参皂苷Rg1 100 μmol/L组

3　讨论

心肌缺血再灌注损伤由Jennings于1960年第一次提出，是指细胞因缺血发生可逆性的损伤，在缺血纠正后，这种损伤反而更加严重，继而引起细胞死亡或进一步的功能障碍。近年来，随着冠状动脉再通治疗，如溶栓疗法、经皮冠脉介入疗法、冠状动脉旁路搭桥术及心脏移植术的广泛应用于临床，其严重的并发症—心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的防治日益受到重视。

人参皂苷Rg1是人参中提取的皂苷类有效成分之一，具有抗心肌缺血再灌注损伤作用。Zhu等［3］研究表明，在缺氧/复氧刺激的大鼠心肌细胞，人参皂苷Rg1通过增加超氧化物歧化酶，减少活性氧及抑制细胞内Ca2+超载，发挥抗氧化及维持细胞内Ca2+稳态作用。Wei等［4］研究显示，人参皂苷Rg1可稳促大鼠心室微血管生成，恢复灌注后梗死区域的心肌功能。张庆勇等［5］研究证明，人参皂苷Rg1通过减小大鼠心肌梗死面积、增加梗死区边缘的微血管密度及心肌组织内一氧化氮水平达到治疗效果。Wang等［6］研究显示，人参皂苷Rg1使心肌梗死家兔局部心肌组织中的粒细胞集落刺激因子诱导骨髓外周血单个核细胞迁移至心肌组织，使血管内皮细胞进一步分化，血管内皮细胞的再生促进梗死心肌组织毛细血管再生以恢复血液供应。研究表明，人参皂苷Rg1可通过PI3K/Akt信号通路上调HIF-1α及其下游基因VEGF在人脐静脉内皮细胞中的表达以促进血管新生［7，8］。

PI3K-Akt途径是正常细胞内存在的细胞生存激酶信号系统，当细胞发生MIRI时，其被激活而抑制细胞的凋亡，称为再灌注损伤补救激酶，它在心肌再灌注损伤中起着极为重要的保护作用［9］。文献报道，人参皂苷类成分其发挥心肌保护作用的机制主要通过激活PI3K/Akt-eNOS级联和ERK1/2信号传导通路(即RISK通路)，促进血管内皮细胞产生NO，扩张冠脉血管，增加冠脉血流，发挥心肌保护作用［10，11］。但人参皂苷Rg1能否在动物离体心脏发挥抗心肌缺血再灌注作用及是否与激活PI3K-Akt和ERK1/2信号通路有关尚未见报道。

本研究制备大鼠Langendorff离体心脏缺血再灌注损伤模型，应用100 μmol/L人参皂苷Rg1进行预处理，发现人参皂苷Rg1能改善心脏血流动力学，如RPP恢复率、左心室内压最大上升速率恢复率、左心室内压最大下降速率恢复率;降低心脏灌流液中CK、LDH。人参皂苷Rg1上调心肌p-Akt、p-GSK-3β(Ser-9)蛋白表达，提示激活PI3K-Akt信号通路在人参皂苷Rg1的心肌保护中发挥了重要作用。

参考文献

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2 Li W，Chu Y，Zhang L，et al.Ginsenoside Rg1 prevents SK-N-SH neuroblastoma cell apoptosis induced by supernatant from Aβ1-40-stimulated THP-1 monocytes.Brain Res Bull，2012，88:501.

3 Zhu D，Wu L，Li CR，et al.Ginsenoside Rg1 protects rat cardiomyocyte from hypoxia/reoxygenation oxidative injury via antioxidant and intracellular calcium homeostasis.Cell Biochem，2009，108:117-124.

4 Wei HJ，Yang HH，Chen CH，et al.Gelatinmicrospheres encapsulated with a nonpeptide angiogenic agent，ginsenoside Rg1，for intramyocardial injection in a rat model with infarcted myocardium.Control Release，2007，120: 27-34.

5 张庆勇，陈燕萍，刘芬，等.人参皂苷Rg1对大鼠急性缺血心肌血管再生的促进作用.第三军医大学学报，2013，35: 42-45.

6 Wang NY，Lu CJ，Chen XH.Study on effect of ginsenoside Rg1 in promoting myocardiac vascular endothelial cell regeneration through induc-tion on bone marrow stem cell’s migration and differentiation in rabbits of myocardial infarction.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2005，25: 916-919.

7 卢琼，谭睿，崔文婷，等.细胞信号通路与动脉粥样硬化.中国医药生物技术，2012，7:211-215.

8 Yin H，Liu Z，Li F，et al.Ginsenoside-Rg1 enhances angiogenesis and meliorates ventricular remodeling in a rat model of myocardial infarction.Mol Med (Berl)，2011，89:363-375.

9 Hauseuloy DJ，Tsang A，Yellon DM，et al.The reperfusion injury salvage kinase pathway: A common target for both ischemic preconditioning and postconditioning.Trends Cardiovasc Med，2005，15:69-75.

10 Zhou H，Hou SZ，Luo P，et al.Ginseng protects rodent hearts from acute myocardial ischemia-reperfusion injury through GR/ER-activated RISK pathway in an endothelial NOS-dependent mechanism.J Ethnopharmacol，2011，135:287-298.

11 Leung KW，Cheng YK，Mak NK，et al.Signaling pathway of ginsenoside-Rg1 leading to nitric oxide production in endothelial cells.FEBS Lett，2006，580: 3211-3216.

·论著·

Cardioprotection effects of Ginsenoside Rg1 on ischemia/reperfusion injury in isolated hearts of rats

CHEN Haixia，HUANG Guangli，ZHOU Hongying，et al.
Department of Pediatrics，Handan Hospital for Maternal and Child Health，Hebei，Handan 056001，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate cardioprotection effects of Ginsenoside Rg1 on ischemia/reperfusion(I/R) injury in isolated hearts of rats，and to explore its action mechanism.Methods The Langendorff models of myocardial I/R injury in rats were established.The 18 rats were randomly divided into three groups: control group，I/R group and Ginsenoside Rg1 group，with 6 rats in each group.The rats’hearts in Ginsenoside Rg1 group were pretreated with Ginsenoside Rg1 100μmol/L for 10min.The cardiac indexes including maximal rise/fall of left ventricular pressure (±dp/dtmax) and rate pressure product (RPP) were measured，and the activities of creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) were detected.The changes of phosphorylation of protein kinase B/Akt，and its downstream target glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2) were detected after 10－minute reperfusion.Results As compared with those in I/R group，the activities of CK，LDH in Ginsenoside Rg1 group were significantly decreased and cardiac function was obviously improved (P＜0.05)，moreover，the expression levels of p-Akt and p-GSK-3βwere significantly increased (P＜0.05).ConclusionGinsenoside Rg1 can alleviate I/R injury in isolated hearts of rats，and its action mechanism may be correlated to the activation of PI3K-Akt signaling pathway.

【Key words】Ginsenoside Rg1; isolated rat hearts; hemodynamic parameters; creatine kinase; lactate dehydrogenase

(收稿日期:2015－09－09)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.04.001

【中图分类号】R 972

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2016) 04－0485－04

作者单位: 056001河北省邯郸市妇幼保健院