一致性检验比较两种弓形虫抗体检测试剂盒

李知新，刘光远，赵　燕，田进梅，张学军，张和平，吴　润（.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州70070 2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室，甘肃兰州70046；.宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川7500；）



一致性检验比较两种弓形虫抗体检测试剂盒

李知新1,2,3，刘光远2*，赵燕3，田进梅3，张学军3，张和平3，吴润1
（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070 2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室，甘肃兰州730046；3.宁夏动物疾病预防控制中心，宁夏银川750011；）

摘要：比较两个弓形虫抗体检测试剂盒检测结果的一致性，为流行病学调查和临床诊断筛选可合理使用的商品化试剂盒。对510份猪血清分别进行弓形虫抗体IHA和ELISA检测，应用Kappa检验比较两种试剂盒检测结果的一致性并进行分析，用x2检验分析差异性。两种试剂盒联合检出79份阳性，阳性符合率为67.52％，阴性符合率为95.17％，总符合率为88.82％。x2检验差异显著（x2=228.23，p=0.00）；u检验值为15.89，两种产品的一致性为中度一致（Kappa值=0.66）。所以弓形虫病IHA检测试剂盒可作为现场收益流行病学调查，而弓形虫IgG抗体ELISA检测试剂盒适合辅助临床检测和诊断。x2检验比较两种试剂盒具有局限性。u检验排除偶然性造成的一致程度，与Kappa检验结合可比较一致性。弓形虫抗体检测要根据实况选择不同的试剂盒。

关键词：弓形虫；Kappa检验；x2检验；u检验；IHA；ELISA

弓形虫（Toxoplasma）是一种细胞内专性寄生原虫，可引起人兽共患寄生虫病[1]。弓形虫病缺乏特异性临床症状和体征，临床症状表现复杂多变，诊断较为困难，对其有效地诊断显得尤为重要[2]。弓形虫病检测以免疫学为主，如间接血凝试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFA）、胶乳凝集试验（LA）等[3]。目前市售商品化试剂盒种类较多，基层实验室常用IHA和ELISA方法诊断弓形虫病。

Kappa一致性检验在诊断试验中有两种情况中：一种是评价待评价的诊断实验方法与金标准的一致性；另一种是评价两种诊断方法对同一个样本的诊断结果的一致性或两个检验工作者对同一种现象的诊断结论的一致性或同一检验工作者对同一现象前后进行两次观察做出的诊断的一致性[4-6]。应用Kappa检验比较兽医检测试剂盒国外曾有报道。如Willems T等人利用两种商品化的试剂盒，对口蹄疫病毒细胞增值活性进行检测，细胞增殖检测试剂盒和细胞活性检测试剂盒具有极强的一致性（u值=0.85，Kappa值=0.97）[7]；Chen T H等人用Kappa检验比较了口蹄疫病毒液相芯片检测法和3ABC多肽阻断ELISA检测法，两种检测方法的符合率为96.3％，Kappa检验强度极强（Kappa值=0.92）[8]。国内除刘华用Kappa检验比较猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒外[9]，未见其他报道。本试验用两个商品化的弓形虫检测试剂盒开展弓形虫抗体检测，并对检测结果进行了一致性检验和分析，为选择兽医诊断试剂提供科学依据。

1　材料与方法

1.1试剂

弓形体间接红细胞凝集试验试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所（抗原和标准阳性血清批号：20131030，标准阴性血清和稀释液批号：20130815），动物弓形虫IgG抗体ELISA检测试剂盒购自海泰生物制药有限公司（批号：20131106）。

1.2猪血清

510份猪血清采自宁夏16个规模化养殖场和61个散养户。

1.3方法

1.3.1检测方法

1.3.1.1弓形虫间接血凝试验按试剂盒说明书进行操作。结果判定时，阳性对照血清滴度不低于1∶1024；阴性对照血清除第1孔允许存在前滞现象“+”外，各孔均为“-”；稀释液对照为“-”实验成立。被检血清抗体滴度≥1∶64，“++”判为阳性。

1.3.1.2弓形虫IgG抗体ELISA检测将样品和样品稀释液按1:100比例稀释。按照试剂盒说明书进行操作。结果判定时，阴性对照OD450nm≤0.20，临界对照0.2＜0OD450nm＜0.60、阳性对照OD450nm＞0.60时，试验成立。被检样品OD450nm＞临界对照OD450nm×1.1判为阳性；被检样品OD450nm＜临界对照OD450nm×0.9判为阴性；介于二者之间判为可疑，需重新测定。

1.3.2Kappa系数的计算制作C×C列联表，按照参考文献[4-6]方法计算Kappa值。

1.4统计学方法和参考判断指标

采用SPSS20.0统计学软件对2种产品检测的阳性率进行x2检验；u检验按照参考文献[4]计算，用来排除抽样误差的影响，在α=0.05的检验水准下＜0.05在统计学上认为Kappa值并非由抽样误差所致，如果u值＜1.96，则＞0.05，则Kappa值大小没有意义。一致性检验进行Kappa分析，当K＜0，极差；0.0～0.2，微弱；0.21～0.40，弱；0.41～0.60，中度；0.61～0.80，高度；0.81～1.00，极强[10]。

2　结果

IHA试剂盒单独检出98份阳性，阳性率19.22％ （98/510），IgG抗体ELISA试剂盒单独检出117份阳性，阳性率22.94％（117/510），IgG抗体ELISA试剂盒检测阳性略高于IHA试剂盒，经x2检验差异显著（x2=228.232，p=0.00）。

两种试剂盒联合检出79份阳性，阳性率符合率为67.52％（79/117），阴性符合率为95.17％（374/393），总符合率为88.82％（453/510）。为排除因抽样误差等偶然性导致两种结果的一致性，进行u检验，经检测u检验值为15.89，大于95％标准正态分位数1.96，Kappa一致性检验值为0.66，表明两种产品的一致性强度为中度。两种试剂盒同时检测510份血清结果见表1。

3　讨论

Kappa一致性检验在医学、农业等众多领域中应用较为广泛[6,9-12]。在检验医学研究工作中，常遇到两种检测方法或两名检验人员的检测结果是否一致以及用同一种方法进行多次测定的结果能否重现的问题[6]。国内在兽用疫病检测试剂盒、实验室比对等方面应用一致性检验的方法对检验结果进行分析报道不常见。

有关文献中常见用符合率、x2检验、t检验和回归系数等方法间接反映两种结果的一致性，这些统计方法都存在局限性和不足[5]。在比较试剂盒之间的一致性时，x2检验只能分辩两者差异有无统计学意义，不能反映两者是否一致，甚至可能得出完全相反的结论，这与王洁贞等人的观点一致[4]。而Kappa检验不仅可用于一致性检验，而且能给出一个反映一致性程度的值[5]。根据实际资料计算的K值只是一个样本的统计量，存在着抽样误差，因而，所计算的K值是否来自K值为“0”的总体（即两者之间的一致程度是由于机遇造成的），应当经过假设检验（u检验）[6]。本试验u检验值为15.89，大于95％标准正态分位数1.96，故P＜0.05，可以排除偶然性导致的两种结果的一致，在α=0.05的检验水准下可认定两种检验方法具有一致性，且根据Kappa值为0.66这个判断指标，表明两种产品的一致性强度为中度，说明这两种试剂盒在血清学调查中差异不显著，而x2检验表明两种试剂盒检测差异显著。

弓形虫虫体蛋白质基因组复杂，在宿主体内产生的抗体也就不同。虽然重组抗原诊断弓形虫病的特异性很高，但敏感性仍低于天然抗原，将多个重组抗原组合成“鸡尾酒”式的诊断抗原或重组复合多表位诊断抗原等方法有望克服漏检现象，提高诊断的准确性[3]。但是弓形虫病的IHA一般在病后1个月左右出现阳性[13，15]，因此，除人为因素外，与阳性出现的早晚有很大关系，而且IHA操作简便，不需要特殊检测仪器，因此认为该方法更适用于现场流行病学调查，这与李冕、Patton S等人的观点一致[2,13]。周海宁等人认为弓形虫间接血凝方法阳性检出率低，结果判定与人为因素影响大有关，而弓形虫IgG抗体ELISA方法客观、敏感，省时、快捷，更适合于血清学调查[14]。由于该方法可出现假阳性，建议应用于辅助临床检测和诊断，这与陈丽萍等人观点一致[15]。因此，应根据现有诊断资源合理选择弓形虫病的诊断方法，以适应不同感染阶段的诊断和不同目的的检测。

表1　两种试剂盒检测结果比较

参考文献:

[1]Sibley L D，Boothroyd J C.Virulent strains of Toxoplasma gondii comprise a single clonal lineage[J].Nature，1992，359（6390）：82-85．

[2]李冕，尹昆，闫歌.弓形虫病的诊断技术及其研究进展[J].中国病原生物学杂志，2011，6（12）：942-944．

[3]卢志民，张进顺.弓形虫感染免疫诊断抗原研究进展[J].中国血吸虫病防治杂志，2011，23（5）：590-594．

[4]王洁贞，韩兢，刘彦训，等.Kappa统计量在一致性和重现性检验中的应用[J].山东医科大学学报，1996，34（3）：209-212．

[5]李春波，何燕玲，张明园.一致性检验方法的合理应用[J].上海精神医学，2000，12（4）：228-232．

[6]夏邦世，吴金华.Kappa一致性检验在检验医学研究中的应用[J].中华检验医学杂，2006，29（1）：83-84．

[7]Willems T,Lefebvre D J,Neyts J,et al.Diagnostic performance and application of two commercial cell viability assays in foot-and-mouth disease research[J].J Virol Methods,2011,173(1):108-14.

[8]Chen T H,Lee F,Lin Y L,et al.Development of a Luminex assay for the detection of swine antibodies to non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus[J].J Immunol Methods,2013,396(1-2):87-95.

[9]刘华，詹松鹤，何长生，等.应用Kappa检验比较猪蓝耳病ELISA抗体检测试剂盒[J]．中国动物检疫，2014，31 （11）：95-96．

[10]田苗，王鹏新，严泰来，等.Kappa系数的修正及在干旱预测精度及一致性评价中的应用[J].农业工程学报，2012，28（24）：1-7.

[11]张波．Kappa一致性检验在流行病学中的应用举例[J].宁夏医学院学报，1995，17（4）：336-337．

[12]Pietkiewicz H，HiszczynskaSawicka E，Kur J，et al.Usefulness of Toxoplasma gondii specific recombinant antigens in serodiagnosis of human toxoplasmosis[J].J Clin Microbiol，2004，42(4)：1779-1781．

[13]Patton S，Johnson S S，Puckett K．Prevalence of Toxoplasma gondii antibodies in nine populations of dairy goats：compared titers using modified direct agglutination and indirect hemagglutination[J].J parasitology，1990，76(1)：74-77．

[14]周海宁，张成莲，王进香，等.猪弓形虫血清学检测方法比较[J].中兽医医药杂志，2014：38-39．

[15]陈丽萍，陈慰，桂馨.ELISA弓形虫IgG抗体试剂盒的研制[J].放射免疫学杂志，2002，15（1）：57-59．

通讯作者：刘光远*

作者简介：李知新（1981-），男，宁夏隆德人，高级兽医师，在读兽医博士，主要从事动物疾病预防与控制研究。

基金项目：宁夏回族自治区科技支撑项目（2013ZZN30）

中图分类号：S855.9

文献标识码：B

文章编号：1006-799X(2016)12-0081-02