低温胁迫对荷那龙罗非鱼内脏组织脂肪酸变化的影响

葛仲显，陈彦君，陈　刚，张健东（甘肃省庆阳市水产工作站，甘肃庆阳745000）



低温胁迫对荷那龙罗非鱼内脏组织脂肪酸变化的影响

葛仲显，陈彦君，陈刚，张健东
（甘肃省庆阳市水产工作站，甘肃庆阳745000）

摘要：实验以荷那龙罗非鱼（Oreochromis hornorum）为研究对象，在室内控温循环水族箱内，按照1℃/d的速度，将温度分别从暂养的25℃，降到25℃、20℃、18℃、16℃、14℃、13℃、12℃几个实验温度组进行低温胁迫实验，每隔10 d定期取样，取样5次，取背侧肌、肝胰脏、肠和内脏脂肪组织四个组织的样，来分析低温胁迫对实验对象所造成的影响。结果发现：在实验过程中，肠和肝胰脏组织没有明显的变化规律；背侧肌和内脏脂肪组织在实验期间两者SFA和MUFA都随着取样时间的延长，所占脂质的百分含量下降，各组间的差异显著(<0.05)，PUFA百分含量上升(<0.05)，内脏脂肪组织SFA和MUFA下降，PUFA上升，差异极显著水平(<0.01)。

关键词：荷那龙罗非鱼；低温胁迫；气相色谱

罗非鱼由于其适应性强、生长周期短，在各省市有大面积的养殖，但是养殖过程中，由于自然界中季节更替、环境剧变或食物分布不均等原因，动物经常受到节律性或突发性胁迫。温度胁迫，就是最为常见的一种环境胁迫因子，罗非鱼对低温的耐受能力相对较差，在10℃以下，就开始有死亡现象出现。由于动物对各种环境因子的承受能力有限，任何一种因子，超过它的耐受能力，就会影响生长状况，甚至出现死亡。

低温胁迫在植物中的研究较为深入，以鱼类为研究对象的较少，梁友光等[1]对长吻鮠越冬的生理生化适应进行了比较的深入研究，王晓杰等低温胁迫下许氏平鲉补偿生长[2-5]也进行了相关的研究，进一步解释了补偿生长的可能机制[6]。常玉梅等[7-8]和丁雷[9]对鲤鱼的低温胁迫进行了研究，反映出低温胁迫下鲤鱼血液生理生化指标等所受到的影响。

在罗非鱼中的低迫胁迫研究较少，本实验以荷那龙罗非鱼为研究对象，分别取背侧肌、肝胰脏、肠和内脏脂肪组织作为样品来分析低温胁迫对实验对象所造成的影响，实验中没有涉及补偿生长，在几种实验温度组内，持续长时间的取样，对比分析，体内营养物质的利用顺序和优先利用的组织，以期为相关的研究提供相应的理论数据参考和技术支持。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.2实验试剂

已醚、浓盐酸、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸、甲醇、氯仿、氯化钠、正已烷、氢氧化钾、异辛烷、无水硫酸钠等以上所用的药品均为分析纯。

1.3实验器材

凯氏定氮仪、水浴锅、离心机、索氏抽提仪、气相色谱仪、氮气吹干仪、粉碎机、涡旋振荡器、旋转蒸发仪、微量移液器等指标测量用具及实验中常用的解剖用具。

1.4实验方法

1.4.1实验取样方法实验将在25℃下暂养2周的荷那龙罗非鱼，在室内循环水族箱内进行分组实验，实验共设有7个温度组，分别为25℃、20℃、18℃、16℃、14℃、13℃、12℃，其中以25℃组为对照。将暂养结束的鱼，每个温度组分90尾，设3个平行，每个平行组放养30尾，以1℃/d的速率开始从25℃降温，降到所需的温度组后，开始计时，取样时间为0 d、10 d、20 d、30 d、40 d和50 d，共取样6次，每个平行组取3尾鱼。

取样时取出的实验对象用纱布擦干表面的水分，现场测量样品实验对象的全长，体长，然后称取鱼体体重。在冰盘中解剖，取出内脏团，用生理盐水洗去附着血液，滤纸吸干后对其进行称重，之后再分离出肝胰脏、去除内溶物的肠组织、内脏中脂肪组织，同样用滤纸吸干后对其称重。最后，取鱼的背侧肌肉，用手术剪后，取下，称重。所有的样品取完后均采用-20℃冰箱保存。长度精确到0.1 cm，重量精确到0.01 g。

1.4.2样品处理方法在105℃下，烘干，测定水分含量后，将肌肉样粉碎。取0.3 g烘干之后的样品，采用氯仿-甲醇法，于15 ml的离心管中,加CHCL3/CH3OH/H2O= 1∶2∶0.8的混合液7.6 ml，超声波提取2 min,剧烈震摇5 min，3 000 r/m离心10 min，取上清液于分液漏斗中。重复2～3次，合并液体，向分液漏斗中加入6 ml CHCL3,使CHCL3/CH3OH/H2O=2∶2∶0.8，震摇30 s，再向分液漏斗中加饱和氯化钠水溶液6 ml，使CHCL3/CH3OH/H2O=2∶2∶1.6，震摇30 s，分层后，下层旋转蒸发至恒重，得粗脂肪，冷冻保存[10]。其他组织采用索氏抽提法提取所含有的脂类物质。

皂化方法：向冷冻保存的总脂中加2 ml氢氧化钾-甲醇(4:1），充N2后，于60℃水浴皂化2h，皂化液转移至15 ml的离心管中，用HCL调pH<1,加饱和氯化钠水溶液1ml，用氯仿2ml∶正己烷(1∶4)洗样品瓶合并到离心管中，涡流振荡，离心4000r/m10min，取上层分析[10-30]。

皂化之后的样品采用，GB-T 17376-2008的方法采取酯交换法处理，得到甲酯化之后的样品，用Aligent 7890GC气相色谱仪测定脂肪酸的组成。

处理条件如下：HP-FFAP的色谱柱，进样口温度250℃，分流比50∶1，流速1.8 ml/min，检测器温度270，FID检测器，氢气流速35ml/min，氮气流速35 ml/min，空气流速350 ml/min。升温程序：起始温度110℃，以8℃/min的速度升至220℃，保持16 min。

气相色谱的测定结果，采用面积归一化法，测定各种脂肪酸的百分含量[11]。

具体的方法如下：

校正因子的计算：第i组分的校正因子按下式计算：

fi—第i组分脂肪酸甲酯的校正因子；

Ci—标准样中组分i的浓度；

Ai—标准样的组分i的色谱峰面积。

样品中各脂肪酸的质量分数按下式计算：

wi—某脂肪酸的质量分数％；

∑(fi·Ai)—所有组分的校正因子与色谱峰面积之和。

1.4.3数据处理方法实验所得到的所有的实验数据均采用SPSS17.0软件进行方差分析、Turkey法进行多重比较。

2　结果与讨论

2.1低温胁迫对形态学指标的影响

实验期间，除对照组没有明显的变化规律外，其他各实验组的实验对象肝体指数、脏体指数和肥满度都随着取样时间的延长而下降，起始值相比差异显著(<0.05)。

2.2低温胁迫对肌肉成分的影响

肌肉成分为的水分含量随取样时间的延长，水分所占百分含量上升，温度越低，上升幅度越大，25℃没有变化，水分含量差异不显著，其他的各个温度组，起始值相比差异显著(<0.05)。粗脂肪含量表现出和水分含量不同的变化趋势，随着取样时间的延长，含量下降，温度越低下降越快，和起始时的含量相比差异显著(<0.05)。

2.3低温胁迫对体内组织脂肪酸成分的影响

2.3.1低温胁迫对肝胰脏脂肪酸成分的影响肝胰脏中脂肪酸的共测得25种，其中命名的有22种，所有碳原子的分布为12～24个碳原子之间，含量最多的是16 和18个碳原子的脂肪酸，其中SFA的含量变化范围为20.99％～48.49％，UFA的变化为33.08％～60.57％，MUFA从12.92％～36.98％，PUFA从18.46％～28.21％。SFA的均值为37.18％，UFA的均值为52.18％。

双因素的方差分析的结果得知，温度和取样天数均对结果产生了极显著的影响（<0.01）。SFA的变化在10 d取样时，含量最高，在六次取样过程中，有两个高峰出现，分别是10 d和40 d，数据差异极显著。所有的温度组有先上升，后下降，再上升，后下降的趋势。在相同的取样次数下，20℃数值差异最大。25℃没有明显变规律。

单不饱和脂肪酸也有两个峰值出现，分别在0 d、30 d的两次样时，整体趋势是先下降后上升，最后下降，各组值的结果差异极显著。但是在相同的取样时间时，各温度组的规律却是先上升，后下降，再上升的趋势，变化规律不明显。

PUFA除了对照组25℃之外，其余几个组均有明显的规律呈现出来，在10 d、40 d取样时，出现数值高峰，整体的趋势是先上升，后下降，再上升，最后回落。各取样结果间的差异极显著。在不同的取样温度下，各组没有明显的规律出现。n-3 PUFA、n-6PUFA没有体现出明显的规律。

2.3.2低温胁迫对肠脂肪酸成分的影响对鱼肠组织的脂肪酸进行分析时，总共发现25种脂肪酸，其中命名的有22个，碳原子数分布范围12～24之间，丰度最高的是16和18碳的脂肪酸，实验期间，饱和脂肪酸（SFA）的变化范围27.25％～51.08％，不饱和脂肪酸（UFA）的变化范围为40.21％～55.18％，其中单不饱和脂肪酸（MUFA）为含量变化范围为20.42％～30.07％，多不饱和脂肪酸（PUFA）的变化范围为16.09％～30.87％见图1、2。

图1　低温对A组鱼体肠组织SFA含量的影响

图2　低温对A组鱼体肠组织MUFA含量的影响

由双因素的方差分析结果得知，SFA的变化受温度的和天数的影响，各组值之间差异极显著。在相同的温度，不同的取样时间下，饱和脂肪酸先上升后下降，和对照组相比，在较低的温度组，上升的趋势不明显。对应相同的取样时间时，组间的差异不明显。

由双因素的方差分析结果得知，MUFA的变化受温度的和天数的影响，各组值之间差异极显著。MUFA在相同的取样温度下，25、20℃有先下降，后上升再下降的趋势，从18℃开始，后面的几个温度组，随着取样时间的延长，含量极显著下降，没有上升的趋势。而在相同的天数，不同的温度下取样时，随着温度的下降，MUFA的含量呈现出了明显的下降趋势，而且温度越低，含量越低。

图3　低温对A组鱼体肠组织PUFA含量的影响

由上图可以可出，鱼肠中的PUFA的变化规律是随着取样时间的延长，含量显著上升，不同的温度组间，温度越低，含量越高。

2.3.3低温胁迫对内脏脂肪组织脂肪酸成分的影响A组鱼的内脏组织中含有21种脂肪酸，不含有C24∶0，碳原子分布范围与上述结果相同，为12～24个碳原子之间，含有丰富的16和18个碳原子的脂肪酸，C16∶0（棕榈酸）20.06％～23.79％、C16∶1（棕榈烯酸）3.91％～5.89％、C18：0（硬脂酸）0.11％～6.08％、C18：1（油酸）25.54％～29.93％、C18∶2（亚油酸）0.22％～17.38％、C18∶3（亚麻酸）0.10％～1.25％、EPA（二十碳五烯酸）0.24％～0.89％、DHA（二十二碳六烯酸）0.91％ ～3.69％。SFA、UFA、MUFA、PUFA的变化范围分别为27.42 ％ ～34.92％、43.69％ ～61.82％、35.49％ ～40.53％、5.30％～23.31％。

图4　低温对A组鱼体内脏脂肪组织SFA含量的影响

由图4可以看出，对照组在整个实验过程中，SFA没有明显的变化规律，其他各实验组的SFA含量都有下降的趋势，而且14℃以下的实验组下降的更加明显，特别到第4次实验取样时，内脏内很少有脂肪组织，所以相比其他组织的样，只有3次样，可能为低温过程中身体的各种代谢提供能量，消耗较大。

图5　低温对A组鱼体内脏组织MUFA含量的影响

由图5可以看出，对照组的MUFA含量变化较大，没有明显的变化规律，其他的实验组的规律和SFA相似，有明显的下降趋势，温度越低下降越明显。MUFA和SFA的结果来看，各组之间的差异更大，除对照组外，各组虽然有相同的变化趋势，但组间表现出来的数值差异也很大，可能的原因是饱和脂肪酸代谢的中间产物为单烯酸。

图6　低温对B组鱼体内脏组织PUFA含量的影响

由图6可以看出，PUFA表现和SFA、MUFA完全相反的规律，这和肌肉中PUFA表现的规律相同，都随取样时间的延长，所占的百分数上升，可能是因为SFA和MUFA被利用，导致含量上升，或者其他更深层次的原因存在，实验中未能发现。

3　结论

实验结果发现，在不同的强度的低温胁迫下，各取样时间点间差异明显，肝体指数、脏体指数和肥满度几个形态学指标都随着取样时间的延长而下降；肌肉粗水分上升，粗脂肪含量下降，粗蛋白在实验条件下，没有发生明显的变化。

荷那龙罗非鱼的四种组织中脂肪酸的变化也表现明显的规律，肌肉和内脏脂肪组织中SFA和MUFA下降，PUFA上升；肠和肝胰脏中脂肪酸变化没有规律。在低温胁迫下，荷那龙罗非鱼可能优先利用内脏脂肪组织和肌肉中的能量，出于对脏器的保护作用最后利用肝胰脏和肠中存在可利用能量。

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作者简介：葛仲显（1985-），男，甘肃庆阳人，农艺师，主要从事水产方面工作。

中图分类号：S912

文献标识码：B

文章编号：1006-799X(2016)01-0069-04