电化学发光技术测定25羟基维生素D的性能验证

向　波，刘忠民，覃润东

(广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510120)



·临床研究·

电化学发光技术测定25羟基维生素D的性能验证

向波，刘忠民，覃润东

(广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510120)

摘要:目的对电化学发光技术检测25羟基维生素D项目进行性能验证，以确保实验室检测结果的准确。方法依据国家标准文件，对电化学发光技术检测25羟基维生素D的精密度、正确度、线性范围、参考区间进行验证试验。结果高、低浓度的批内变异系数(CV)分别为3.18%和3.38%，批间变异系数分别是13.37%和6.23%，均小于厂家声明的不精密度或验证值；正确度验证试验偏倚未超过原卫生部规定的最大允许误差的1/2；验证的线性范围为3.165～48.515 ng/mL；参考范围验证20份体检标本检测结果均在厂家提供的参考区间内。结论电化学发光技术检测25羟基维生素D项目性能验证通过，可用于临床检测。

关键词:25羟基维生素D；性能验证；精密度;电化学发光技术

维生素D状态评估是防止骨质疏松症的基础环节，众多研究均强调良好的维生素D状态对骨骼健康和长期接受抗骨质疏松治疗非常重要。在老年人常见的高血压、肿瘤(前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等)、糖尿病、多发性硬化、免疫功能失调等疾病的发生、发展过程中，维生素D也起重要作用。血清25羟基维生素D是评估维生素D状态的最佳指标[1]。本实验室拟开展25羟基维生素D检测项目。按照中华人民共和国卫生行业标准《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证(WS/T 420-2013)》要求，临床实验室使用厂家已经过严格评估的检验方法或试剂盒之前，还要验证相关分析性能以证实在本实验室能达到厂家声称的分析性能指标，从而保证检验结果准确。因此本实验室对电化学发光技术检测25羟基维生素D的精密度、正确度、线性范围、生物参考区间进行验证。

1材料与方法

1.1标本来源选择2014年8月1日至10月31日在本院就诊患者和体检者的新鲜血清和中山大学附属第一医院(以下简称中大附一医院)体检者的新鲜血清，标本无溶血、黄疸、脂浊。

1.2仪器与试剂德国Roche公司Modular E170全自动电化学发光免疫分析仪，所用试剂为仪器原装配套试剂盒、定标液、质控液。

1.3方法

1.3.1精密度验证选择低浓度(批号173190)和高浓度(批号173191)两个浓度水平的质控品，试验持续5 d，每批每个水平重复测定3次，计算批内不精密度、批间不精密度。若实测结果小于厂家声明的不精密度或验证值，则结论为精密度验证通过。

1.3.2正确度验证本科室与使用相同检测系统的中大附一医院检验中心进行结果比对，在获取的20份标本中随机抽取5份已在中大附一医院检验中心测定25羟基维生素D的标本，在本实验室进行测定，得出结果进行对比，若结果偏倚未超过允许范围，验证通过。

1.3.3线性范围验证选择低(L)、高(H)浓度水平混合血清(尽可能接近说明书的线性高低值)，按比例配制成系列浓度的6个标本：5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H。在质控在控的情况下，每个标本重复测定2次。判断标准：预期值与实测值作回归统计，斜率在0.97～1.03并且R2≥0.95则认为在该浓度范围内呈线性。

1.3.4生物参考区间验证表面健康人入选原则：从既往检验人员中获取20例表面健康者，考虑性别和年龄分布。具体人员情况：共20例。其中男10例，年龄21～70岁；女10例，年龄23～69岁。判断标准：若20份标本的检测结果均在厂家提供的参考范围内，则实验室可直接使用厂家提供的参考范围。

2结果

2.1精密度验证批内及批间不精密度结果见表1,批内及批间标准差与验证值见表2。

表1　　批内及批间不精密度

2.2正确度验证5份标本比对结果见表3。

2.3线性范围验证维生素D的低值和高值分别是3.16、48.52 ng/mL。统计软件多项式回归数据拟合结果显示：线性方程为Y=1.002 9X+0.069 3，R2为0.999 1，斜率为1.003。见表4。

表2　　批内及批间标准差与验证值比较

2.4生物参考区间验证厂家提供的参考范围：>20 ng/mL;20份体检标本检测结果最低值为20.55 ng/mL，最高值为50.28 ng/mL，均值为30.90 ng/mL。

表3　　正确度验证结果

表4　　线性试验的实测均值与预期值

3讨论

维生素D有广泛的生理作用，不仅可以维持钙、磷浓度的稳定，促使骨的矿化，还能诱导细胞分化、抑制细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡以及免疫调节作用，是癌症和其他慢性疾病风险的独立预示因子[2]。如有文献报道，宫颈癌患者的维生素D水平显著低于健康人群[3]。维生素D因与阳光关系密切，又称为阳光维生素[4]。但是近年由于环境污染加剧、雾霾天气增加等因素，人类从大自然中摄取维生素D的途径越来越少[5]。因此，实验室及时开展维生素D检测，监测人体的维生素D水平，对预防疾病、维护机体健康有着重要意义。

根据2003年CLIA′88更新说明，由FDA证实的、未被修改的中等复杂的检验项目，在实验室报告患者结果前，需检查(确认)在产品说明书中的厂商性能指标：正确度、精密度、可报告范围、参考范围。我国的卫生行业标准也明确提出：临床实验室应在正式使用商品定量试剂盒前，对厂家声称的各项主要分析性能指标进行验证，依据CLIA′88要求，临床实验室可只对正确度、精密度和线性主要分析性能进行验证[6]。本实验室即依据以上标准，对25羟基维生素D检测项目进行开展前的性能验证。

本次精密度验证严格按照国家标准文件《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证(WS/T 420-2013)》进行设计和结果判读。如果计算值小于或等于厂家声称值，则验证厂家声称的重复精密度可靠。如果计算值大于厂家声称值，则需将计算值与验证值比较，如小于验证值，说明此差异无统计学意义，表明厂家声称的重复精密度可靠。本试验的精密度验证批内变异系数分别是3.18%和3.38%，均小于制造商声明的批内变异系数(6.50%和4.20%)；而批间变异系数分别是13.37%和6.23%，大于厂家声称值，但小于验证值。因此，本实验室电化学发光技术检测25羟基维生素D精密度验证通过。

本次正确度验证是依据中国合格评定国家认可委员会CNAS-CL38-《医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明》中5.6.3.2条款执行:对没有开展能力验证/室间质评的检验项目，应通过与其他实验室(如已获认可的实验室，使用相同检测方法的实验室，使用配套系统的实验室)对比，判读检验结果的可接受性。该条款要求：样品数量至少5份，包括正常和异常水平，频率至少每年2次，判定标准为应有不低于80%的结果符合要求[7]。25羟基维生素D属于无室间质量评价项目，根据CNAS-CL38中5.6.3.2替代方案，本次正确度试验选取的5份标本，偏倚均小于卫生部最大允许误差的1/2，正确度验证通过。

本次线性范围的验证是严格按照国家标准文件《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证(WS/T 420-2013)》进行设计和结果判读。当实验室新使用一种试剂时，必须确定其线性范围，因线性范围宽窄对于定量检测的临床化学分析方法极为重要[8]。Roche公司对于25羟基维生素D声明的线性范围为3～70 ng/mL，由于临床上患者高值标本十分缺少，无法满足厂商提供的线性范围。本试验选取了尽量靠近试剂说明书的线性高低值，低值为3.165 ng/mL，高值为48.515 ng/mL。统计软件多项式回归数据拟合结果显示：线性方程为Y=1.002 9X+0.069 3，R2为0.999 1，斜率为1.003。斜率在0.97～1.03并且R2≥0.95，本实验室验证的线性范围为3.165～48.515 ng/mL。

本次生物参考区间的验证是严格按照国家标准文件《临床实验室检验项目参考区间的制定(WS/T 402-2012)》进行设计和结果判读。若实验室希望或需要对参考区间进行验证，则实验室可以从本地参考人群中筛选少量参考个体(n=20)，将其测得值与参考区间的原始参考值相比较。若20个测定值中落在参考限外的测定值不超过2个，则该参考区间可直接使用[9]。本次生物参考区间验证结果均在厂家提供的参考区间内，实验室可直接使用厂家提供的25羟基维生素D参考范围(>20 ng/mL)。

参考文献

[1]朱汉民，程群，甘洁民，等.上海地区人群维生素D状态研究[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2010，3(3)：157-163.

[2]Fleet JC,DeSmet M,Johnson R,et al.Vitamin D and cancer:a review of molecular mechanisms[J].Biochem J,2012,441(1):61-76.

[3]蔡叶樨，张红河，倪慧群，等.血浆Th17细胞相关因子与25-羟基维生素D检测对宫颈癌的临床价值[J].全科医学临床与教育，2014，12(3):263-265.

[4]查锡良.生物化学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2010:435-436.

[5]考验，施卫星，陈枢青.环境污染物质对儿童身高发育迟缓的影响[J].国际儿科学杂志，2009,36(5)：491-493.

[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.中华人民共和国卫生行业标准 临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证[S].北京：中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,2013.

[7]中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL38医学实验室质量和能力认可准则在临床化学检验领域的应用说明[S].北京：中国合格评定国家认可委员会，2012.

[8]吴惠，吴炯，郭伟，等.临床常用线性评价方案的应用比较[J].检验医学，2006，21(6)：576-580.

[9]中华人民共和国卫生部.中华人民共和国卫生行业标准 临床实验室检验项目参考区间的制定[S].北京：中华人民共和国卫生部，2012.

(收稿日期：2015-12-26)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.029

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0786-03