实时荧光定量聚合酶链反应检测食管癌患者血清miR-100表达的意义*1

施秀英，王　琪，蒋钘钰，徐　林，吴　杰，张　晨，袁　杰，鞠少卿

(1.南通大学附属医院检验科,江苏南通 226001；2.南通大学公共卫生学院医学检验系，江苏南通 226019)



·论著·

实时荧光定量聚合酶链反应检测食管癌患者血清miR-100表达的意义*1

施秀英1，王琪2，蒋钘钰2，徐林2，吴杰2，张晨2，袁杰2，鞠少卿1

(1.南通大学附属医院检验科,江苏南通 226001；2.南通大学公共卫生学院医学检验系，江苏南通 226019)

摘要:目的检测食管癌患者与健康人血清中miR-100的表达量差异，并探讨其作为食管癌分子诊断指标的可能性。方法采用实时荧光定量PCR方法，检测40例食管癌患者(研究组)和50例体检健康者(对照组)血清中miR-100的表达量，并进行统计学分析。结果研究组及对照组血清中miR-100的表达量分别为6.399±3.541、2.625±1.515，研究组明显高于对照组，差异有统计学意义(t=9.07，P<0.05)。用于食管癌患者诊断的miR-100的ROC曲线下面积为0.832(95%置信区间为0.731～0.934)，当Cut off值为5.285时，miR-100诊断食管癌的灵敏度和特异度分别为65%和95%。结论食管癌患者血清中miR-100表达较健康人高，有望成为该疾病辅助诊断的新分子标志物。

关键词:食管癌；微小RNA；实时荧光定量聚合酶链反应

食管癌是一种常见的恶性肿瘤，其病死率在我国为恶性肿瘤疾病的第四位[1]。由于缺乏早期诊断的灵敏指标，食管癌患者多数起病隐匿、预后较差，所以早期诊断、早期预防对患者的治疗及预后意义重大，但目前尚缺乏灵敏度及特异度高的血清检测指标。微小RNA(miRNA)是一类内源性的、约17～25 bp大小的非编码单链小分子RNA，主要通过降解靶基因mRNAs或抑制靶基因蛋白翻译参与转录后水平负调控，对细胞分化、增殖、凋亡等多个过程有着重要的调控作用，其表达异常可导致某些疾病的发生，甚至形成肿瘤[2-3]。食管癌相关研究显示食管癌患者中有多种miRNA表达异常，miRNA表达谱可区分正常组织和肿瘤，可作为患者的早期诊断，高危预警的指标[4-7]。本研究采用实时荧光定量PCR方法检测miR-100在食管癌患者和健康人血清中的表达量，并探讨其在食管癌诊断方面的意义。

1资料与方法

1.1一般资料2014年1～12月南通大学附属医院的食管癌患者40例纳入研究组，其中男24例，女16例，年龄40～67岁，平均(56.8±8.9)岁，均未经过放疗或化疗，且按世界卫生组织(WHO)《病理组织学诊断标准(2007年)》确诊。同期本院50例体检健康者纳入对照组，其中男28例，女22例，年龄41～65岁，平均(55.0±7.6)岁。2组研究对象年龄及性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器与试剂7500 实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；高速冷冻离心机(日本日立公司)；紫外分光光度计(德国IimPlen公司)；U6的逆转录引物，荧光定量PCR上、下游引物(广州锐博生物科技有限公司)；逆转录试剂盒(美国赛默飞公司)；RNA Master SYBR Green Ⅰ(瑞士罗氏公司)；mirVana PARIS Kit试剂盒(美国生命技术公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集采集空腹静脉血3 mL于惰性分离胶促凝管中，1 000 r/min离心10 min，将上层血清分装至RNase-free的EP管中，冰盒运送，-80 ℃保存备用。

1.3.2外周血总RNA的提取按照mirVana PARIS Kit试剂盒说明书操作提取RNA。用紫外分光光度计测得RNA浓度和纯度，将提取完毕的总RNA标本冻于-80 ℃保存待用。

1.3.3引物处理miR-100与U6的逆转录引物、荧光定量PCR上、下游引物由广州锐博生物科技有限公司合成。

1.3.4逆转录合成cDNA按照逆转录试剂盒说明书操作合成miRNA的cDNA，收集逆转录产物，将其置于冰箱-20 ℃保存。

1.3.5实时荧光定量PCR按照miRNA实时定量检测试剂盒说明书进行操作。每个扩增反应体系20 μL，包含SYBR Green Ⅰ Mix试剂10 μL，cDNA6 μL，上、下游引物各1 μL，以U6为内参，反应条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 31 s，共40个循环。收集荧光，绘制溶解曲线，通过溶解曲线验证产物的特异度。以经过焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的不含RNA模板的重蒸水(ddH2O)为阴性对照。每个标本做3个复孔，记录每个反应管中的荧光信号到达阈值时所经历的PCR循环(Ct)值，以ROX为参比染料、U6为内参照，采用实时荧光定量PCR中的相对定量法，以2-△△Ct表示miR-100基因表达的相对变化，即F=2 μ-△△Ct，△△Ct=研究组(CtmiR-100-CtU6)-对照组(CtmiR-100-CtU6)。

2结果

2.1实时荧光定量PCR检测miR-100方法的建立

2.1.1线性关系取一份高值miR-100 cDNA作10倍梯度稀释(1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000)，用实时荧光定量PCR检测Ct值，绘制标准曲线，标准曲线方程为Y=-3.462X+19.612，R2=0.995，根据公式E=10-1/slope-1计算得出扩增效率E=0.983，见图1，说明该检测方法线性良好。

图1　　荧光定量PCR检测血清miR-100的标准曲线

2.1.2重复性选取同一份食管癌患者标本，在同批次荧光定量PCR中设置10个平行孔，进行miR-100cDNA和U6检测，根据Ct值求得批内变异系数(CV)= 0.43%。将同一标本连续进行10次实时荧光定量PCR检测，批间CV=3.89%。

2.2miR-100的血清相对表达量检测实时荧光定量PCR检测食管癌患者血清miR-100的相对表达量为6.399±3.541，高于对照组的2.625±1.515，差异有统计学意义(t=9.07，P<0.05)。

2.3分析miR-100表达水平的诊断价值根据miR-100的结果绘制ROC曲线，见图2，miR-100的AUC为0.832[95%置信区间(CI)为0.731～0.934]，Cut off 值取5.285时，其对食管癌辅助诊断的灵敏度和特异度分别为65%和95%。

图2　　miR-100 ROC工作曲线

3讨论

食管癌是发生在食管黏膜上皮组织的恶性肿瘤，是威胁我国民众健康最为常发的恶性肿瘤之一。由于缺乏灵敏度较高、检测方便的早期诊断指标，大多数患者就诊时已处于中晚期，导致食管癌的治疗及预后均不理想。

大量研究发现，miRNA在多种肿瘤组织中具有不同的表达谱。管晓翠[8]通过低密度芯片技术对食管癌患者和健康人血清中768种miRNA的表达量进行检测，筛选出了21种miRNA在食管癌患者血清中明显上调(2倍以上)，其中包括miR-100在内的9种miRNA尤为明显，变化倍数为1.57～6.42)。于万涛等[9]的研究显示miR-100不仅在多种肿瘤，如宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌等的发生、发展中发挥重要作用，而且还可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Sun等[10]对食管癌组织和细胞系的研究分析中显示，术后恶性组织中miR-100的表达量明显下调，可能是由于肿瘤组织的切除导致miR-100的表达量明显下降。

miRNA在血液中相对比较稳定，本研究利用血清中miR-100作为标志物，研究其在食管癌辅助诊断方面的意义。通过预实验对于每个环节条件的摸索，本研究建立了一个完整检测食管癌患者血清miRNA的荧光PCR体系。在提取食管癌患者血清总RNA后，选用U6作为内参，应用逆转录试剂盒合成miRNA的cDNA，实时荧光定量PCR方法检测miR-100，其扩增曲线平行性好，扩增效率高，溶解曲线呈特异单峰(Tm=77.98 ℃)，提示本研究扩增特异度高，基本无引物二聚体及非特异性产物形成，方法学评价显示本研究中的方法线性、重复性良好。食管癌患者中miR-100的表达量较对照组明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示血清miR-100对食管癌有一定的诊断准确性，血清miR-100有望成为食管癌诊断的有效分子标志物。在以后的研究中需扩大研究病例数，并对患者进行长期随访，以全面评估miR-100对食管癌的诊断、手术疗效、预后等方面的临床应用价值。

参考文献

[1]赫捷,邵康.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策[J].中国癌症杂志,2011,21(7):501-504.

[2]Abba M,Mudduluru G,Allgayer H.MicroRNAs in cancer:small molecules,big chances[J].Anti Cancer Agents Med Chem,2012,12(7):733-743.

[3]Pichler M,Calin GA.MicroRNAs in cancer:from developmental genes in worms to their clinical application in patients[J].British J Cancer,2015,113(4):569-573.

[4]傅敏根,李硕,郁婷婷,等.miR-195在食管癌中的表达及其对食管癌细胞株增殖的影响[J].南京医科大学学报:自然科学版,2013,33(5):575-578.

[5]向正凯,严宝国.食管癌组织中microRNA-21的表达及其意义[J].肿瘤防治研究,2014,41(8):902-905.

[6]蒋敏,顾国浩,张静,等.食管癌患者外周血单个核细胞中miR-21的表达[J].中国现代医学杂志,2013,23(4):34-38.

[7]孟宪琴,刘庚勋.miRNA在消化管癌中的研究进展[J].国际检验医学杂志,2011,32(19):2223-2225.

[8]管晓翠.血清microRNA作为食管鳞状细胞癌诊断及手术疗效评价指标的研究[D].南京：南京师范大学,2013.

[9]于万涛,王朝霞.miR-100与肿瘤关系的研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2014,19(8):747-751.

[10]Sun J,Chen Z,Tan X,et al.MicroRNA-99a/100 promotes apoptosis by targeting mTOR in human esophageal squamous cell carcinoma[J].Med Onco,2013,30(1):411-420.

Value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction in detecting expression of miR-100 in patients with esophageal cancer*1

ShiXiuying1，WangQi2，JiangYanyu2，XuLin2，WuJie2，ZhangChen2，YuanJie2，JuShaoqing1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China;2.InspectionDepartment,PublicHealthSchoolofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226019,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the expression of serum miR-100 in patients with esophageal cancer and healthy person,and explore the value of miR-100 in diagnosis for esophageal cancer.MethodsReal-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction was used to detecting miR-100 in 40 esophageal cancer patients(study group) and 50 healthy person(control group).ResultsThe expression of miR-100 in the study group and control group were 6.399±3.541,2.625±1.515 respective，the expression in the study group was significant higher than that of the control group(t=9.07，P<0.05).The under area of receiver operating characteristic curve of miR-100 in diagnosis for esophageal cancer was 0.832(95% confidence interval was 0.731-0.934)，when the Cut off value was 5.285，the sensitivity and specificity of miR-100 in diagnosis for esophageal cancer were 65% and 95%.ConclusionSerum miR-100 in esophageal cancer patients is higher than that in healthy person,which might be a new molecular markers in diagnosis for esophageal caner.

Key words:esophageal cancer;miR-100;real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction

(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.008

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0738-03

基金项目：南通大学大学生创新训练计划项目(201410304092X)。

作者简介：施秀英，女，副主任技师，主要临床血液学检验研究。