白细胞异常增加对精液质量及氧化应激的影响*1

张俏忻，肖颖秀，程碧珍

(汕头大学医学院第一附属医院:1.检验科；2.神经内科，广东汕头 515041)



·论著·

白细胞异常增加对精液质量及氧化应激的影响*1

张俏忻1，肖颖秀2，程碧珍1

(汕头大学医学院第一附属医院:1.检验科；2.神经内科，广东汕头 515041)

摘要:目的研究白细胞(WBC)异常增加对精液质量及氧化应激的影响。方法共收集52份WBC异常增高精液标本和50份WBC正常精液标本，彩色精子自动分析系统分析精液常规，以鲁米诺为探针，运用化学发光法检测精子活性氧(ROS)水平。分别采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法检测精液中丙二醛(MDA)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的水平。结果WBC异常组和WBC正常组的精液常规参数中总活力、前向运动力和正常精子比率与WBC正常组之间差异具有统计学意义(P=0.008；P=0.005；P=0.003)；精子运动参数中曲线速度(VCL)(P=0.023)、直线速度(VSL)(P=0.010)、平均路径速度(VAP)(P=0.011)、摆动性(WOB)差异具有统计学意义(P<0.05)；精子形态异常率差异具有统计学意义(P=0.008)。WBC异常组较WBC正常组精液标本中ROS、MDA显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，而T-SOD在两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论WBC异常增高可引起精子质量下降，其机制可能与WBC增加释放过多的活性氧有关。

关键词:白细胞；精子；活性氧

白细胞(WBC)在精液中的作用一直存在争议，有文献报道WBC的存在有利于精子质量的提高，可以清除死亡或损伤的精子，留下健康的精子，从而提升男性的生殖能力，增加受孕机会[1-2]。但是某些文献观察到WBC对精子参数呈负面影响，尤其是精子的活力和穿透力，生殖系统感染所引起的WBC精子症被认为是授精能力下降的早期原因[3-4]。WBC是精液中活性氧(ROS)的重要来源，而后者的异常增加可造成精子细胞损伤，本试验旨在研究WBC对精液质量及氧化应激的影响。

1资料与方法

1.1一般资料52例受试个体均来自2013年7～12月汕头大学医学院第一附属医院的生殖中心，共收集52份WBC异常增高(WBC>1×106/mL)的精液标本(白细胞异常组)，标本来自平均年龄(31.3±4.4)岁的男性，50份WBC正常(WBC<1×106/mL)精液标本(WBC正常组)，来自平均年龄(35.4±5.5)岁的男性。两组年龄差异无统计学意义(t=0.988，P=0.219)。

1.2标本采集标本收集及采集时间为禁欲2～7 d后，用手淫法取精液，精液标本使用45%和90%的梯度离心法分离精子，吸取45%和90%中间部分的精子为标本。

1.3精液常规分析使用北京伟力9100精子质量分析系统，将液化后精液混匀，吸出5 μL标本，加到精液计数板中，按世界卫生组织(WHO)规定的标准分析精子各项参数。精液参数包括精液体积、pH值、精子水平、总活力、前向运动力、正常形态精子比率；运动参数包括直线速度(VSL)、曲线速度(VCL)、平均路径速度(VAP)、前向性(STR)、精子侧摆幅度(ALH)、运动直线性(LIN)、摆动性(WOB)、平均移动角度(MAD)、鞭打频率(BCF)；精子形态包括异常形态精子、头部异常、颈部/中断异常及尾部异常。精液WBC检测采用联苯胺染色方法，WBC>1×106/mL被定义为WBC精子症。

1.4精子活性氧ROS检测ROS产物使用鲁米诺(luminol;Sigma Aldrich)作为探针进行检测。精子细胞经PBS清洗后，调整终浓度为20×106/mL收集，少精患者(少于20×106/mL) luminol信号按照精子比例放大到20×106/mL。将溶解在DMSO中的luminol (10 μL,5 mmol/L)加入到400 μL的精子悬液中，立刻记录数据。将5 μL luminol加入到400 μL的PBS溶液中作为空白对照。25 μL H2O2和 10 μL luminol 混合悬液作为阳性对照。荧光信号使用荧光分光光度仪测量15 min。结果用相对荧光单位Relative luciferase activity(RLU)/20×106sperm/15 min表示。

1.5精液微量丙二醛(MDA)测定精子膜脂类过氧化反应的程度以反应产物MDA的产量表示，MDA测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法。取待测精液0.1 mL为测定管，并设测定空白管、标准管及标准空白管，按照说明书操作，分别加入相应试剂。

1.6总超氧化物歧化酶(T-SOD)检测使用黄嘌呤氧化酶法，按照说明书操作，每毫升反应液中超氧化物歧化酶(SOD)抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。

2结果

2.1WBC增加对精子参数的影响WBC异常组总活力、前向运动力和正常精子比率与WBC正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　　精液WBC与精子参数的关系±s)

2.2WBC增加对精子运动参数的影响WBC异常组与WBC正常组相比精子运动参数VCL、VSL、VAP、WOB具有统计学差异 (P<0.05)，见表2。

表2　　精液WBC与精子运动参数的关系±s)

2.3精液WBC与精子形态异常的关系WBC异常组与WBC正常组的精子形态异常率差异具有统计学意义(P<0.05)，其中头部异常增高明显，见表3。

2.4精液WBC对精液中活性氧水平及氧化损伤的影响WBC异常组较WBC正常组精液标本中ROS、MDA显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，而两组T-SOD差异无发现统计学意义(P>0.05)，见表4。

表3　　精液WBC与精子形态的关系

表4　　精液WBC对精液中活性氧水平及氧化损伤的影响

Log(ROS+1)：ROS相对荧光强度的Log转换形式。

3讨论

有文献报道WBC在精子参数、精子功能和男性不育中具有不良作用，与正常生育组相比，不育男性WBC数量明显增加。研究表明，精液WBC增多可导致精液量减少，精子密度、活力、受精能力降低，还可导致精子细胞染色质改变、精子DNA损伤、未成熟生精细胞和畸形精子数目增加等[5-6]。但是，也有学者认为精液WBC增高与男性不育并无关联。Tomlinson等[7]研究显示精液WBC增多或WBC亚群分布变化并不影响精子质量。Kiessling等[8]发现WBC精子症者的正常形态精子增加。本次试验结果显示，WBC异常组总活力、前向运动力和正常精子比率较WBC正常组都有所降低，两组差异具有统计学意义(P<0.05)。同时发现精液中增高的WBC对精子运动参数有影响，WBC异常组与WBC正常组相比，精子运动参数VCL、VSL、VAP、WOB差异具有统计学意义(P<0.05)。有研究表明精子运动能力下降与WBC增高有关，后者可使精子膜上多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，造成精子膜硬度增加，膜流动性减弱，精子运动能力下降甚至丧失。此外，有研究认为随着WBC水平增加，精子畸形率也增加。笔者比较了WBC异常组和WBC正常组的精子形态，结果显示WBC异常组与WBC正常组的精子形态异常率差异具有统计学意义(P<0.05)，其中头部异常增高明显，本次研究结果与相关文献报道一致[9]。

尽管WBC对精液影响的机制尚未完全明确，但已有大量学者致力于此方面的研究，精液WBC中大约有95%是嗜中性粒细胞和巨噬细胞，可通过精子与WBC直接接触或粒细胞产生可溶性物质，释放大量ROS，引发氧化应激，诱导精子细胞损伤和功能丧失。本研究对WBC异常增加的精液标本ROS及MDA、T-SOD进行了比较研究，结果显示WBC异常组较WBC正常组精液标本中ROS、MDA显著增加，具有统计学差异，而T-SOD在两组之间未发现统计学差异。ROS增加的可能机制是：位于精子中段的线粒体鞘是精子运动的供能中心，富含腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，当精液中的WBC增多时，大量释放的ROS可使精子线粒体内外膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，ATP合成减少，最终影响精液质量，导致精子顶体反应和卵细胞融合能力下降，DNA片段增加。活性氧产生和降解的不平衡被认为是精液中氧化应激的一个重要原因，后者可造成精子膜的氧化损伤，导致相关功能的损害，例如精子活动力。有报道显示哺乳动物精子膜的脂质过氧化可导致膜结构的损伤和融合，引起精子活动力的丧失。活性氧通过攻击多不饱和脂肪酸(PUFA)来诱导脂质过氧化(LPO)，进而引起膜流动性下降，造成精子结构和功能的损害。除了膜功能外，LPO派生的醛类例如MDA可以通过氧化DNA碱基或与其共价结合导致DNA链的断裂或交联而引起DNA和蛋白质的损伤。Hsieh等([10])报道MDA水平与少弱精子患者的精子水平和活动力呈负相关，认为增加的MDA水平代表了LPO对精子膜的致病效能，对精子的活动力和生存力有抑制作用。SOD在精浆和精子内都存在，培养过程中加入SOD可以保护精子免受活性氧的攻击。精子计数和总、前向运动力与精液SOD水平有显著相关性，研究发现SOD水平越高精子的数量越多，提示了SOD水平的下降与精液质量的异常有关([11])。但本研究并未发现T-SOD在WBC异常增高组中有显著降低。

综上所述，精液中WBC异常增高可引起精子的质量下降，其机制可能与WBC增加释放过多的活性氧有关。

参考文献

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The impacts of leukocytes elevation on the sperm quality and oxidative stress*1

ZhangQiaoxin1,XiaoYingxiu2,ChengBizhen1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege,Shantou,Guangdong515041,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impacts of leukocytes elevation on the sperm quality and oxidative stress.MethodsA total of 52 elevated leukocytes specimen and 50 normal leukocytes specimen were collected.Standard semen analysis was performed.Reactive oxygen species (ROS) production was measured using luminol as the probe by the Chemiluminescence method.Malonaldehyde(MDA) content in semen was measured by the sulfo-barbitone acid method.Total superoxide dismutase(T-SOD) in semen was measured by the xanthine oxidase method.ResultsThe semen parameters including total motility(P=0.008),progressive motility (P=0.005) and normal forms (P=0.003),the sperm motion parameters including mean curvilinear velocity(VCL)(P=0.023),mean straight-line velocity(VSL)(P=0.010),mean average path (VAP)(P=0.011),swing(WOB)(P<0.001)in the elevated leukocytes group all decreased significantly compared with the normal leukocytes group.The ratio of sperm abnormality in the abnormal leukocytes group increased significantly(P=0.008).ROS levels (using the log-transformation) and Malondialdehyde (MDA) were significantly higher in the elevated leukocytes group,but no significant difference was observed for T-SOD between the two groups(P>0.05).ConclusionThe leukocytes elevation could result in the decrease of spermatozoa quality,which might be related with ROS increase.

Key words:leukocytes；sperm；reactive oxygen species

(收稿日期：2015-12-04)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.003

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0726-03

基金项目：广东省医学科研基金资助项目(A2014441)。

作者简介：张俏忻，男，副主任检验技师，主要从事分子诊断研究。