苜蓿根瘤菌的发酵工艺优化

闫洪雪，刘 露，李 丽，赵宏涛，张鹏鹏，梁文辉

（1.青岛明月海藻集团有限公司，海藻活性物质国家重点实验室，山东青岛 266400；2.青岛明月蓝海生物科技有限公司，山东青岛 266400）

根瘤菌是一类革兰阴性菌，这类菌广泛的分布于土壤中并能与豆科植物共生，通过侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空气中的分子氮，可为植物提供充足的氮素营养[1]，还可降低因施用化肥引起的环境污染。土壤中氮素70%来自生物固氮，而根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系所固定的氮量就占到了约总量的65%[2-3]。草产业在国民经济和农牧业发展中起基础性作用[4]，紫花苜蓿是豆科植物，因具有广泛的适应性和优良的生态效应，品质优良且产量高，在我国的农牧业中占有重要地位[5-6]。苜蓿根瘤菌这一共生固氮体系的稳定高效是栽培苜蓿获得高产的关键因素[7]。随着现代生物技术的发展，科学家对苜蓿根瘤菌的研究越来越深入，从单纯的固氮领域延伸至生理、生化、生态领域，同时也对固氮菌剂、菌肥的开发利用进行了大量探索[8-9]。本研究对豆科植物根瘤菌的发酵工艺进行优化，不仅能够降低生产成本、提高产量，还可减少工业氮肥施用量，减轻环境污染[10]，具有重要的经济、生态效益。

1 材料和方法

1.1 菌种

本研究所用菌种M2为本实验室自行筛选鉴定得到，液体菌种20%甘油-20℃保存。

1.2 常用仪器

电热恒温培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司，LRH-150B）、超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2F）、电热旋转式恒温摇床（江苏太仓市实验设备厂，THZ-D）、涡旋振荡器（澳门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3 试剂

蔗糖、酵母粉、豆饼粉、甘露醇、氯化钠、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、NaOH、HCl、pH试纸。

1.4 基础培养基配方

YMA培养基：甘露醇10 g/L，酵母粉0.8 g/L，氯化 钠 0.1 g/L，KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCO33.5 g/L。

1.5 最适温度的选择

设置温度梯度 26，28，30，32，34 ℃。甘油保存的液体菌种于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液体培养基（灭菌前pH值7.0）中，180 r/min恒温摇床振荡培养36 h后，镜检无杂菌即进行稀释涂布计数。

1.6 最适pH值的选择

设置YMA培养基灭菌前pH值梯度6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。甘油保存的液体菌种于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液体培养基中，180 r/min，30℃恒温摇床振荡培养36 h后，镜检无杂菌即进行稀释涂布计数。

1.7 最佳转速的选择

设置摇床转速梯度 140，160，180，200，220 r/min。甘油保存的液体菌种于冰盒中融化，取500 μL菌液加入到50 mL YMA液体培养基（灭菌前pH值7.5）中，30℃恒温摇床振荡培养36 h后，镜检无杂菌即进行稀释涂布计数。

1.8 优化培养基

用蔗糖代替YMA培养基中成本较高的甘露醇，添加豆饼粉作氮源，设置蔗糖和豆饼粉的不同用量及比例，设6组处理。分别是：（1）蔗糖10 g/L+豆饼粉2 g/L；（2）蔗糖 10 g/L+豆饼粉 4 g/L；（3）蔗糖 16 g/L+豆饼粉 2 g/L；（4）蔗糖 16 g/L+豆饼粉 4 g/L；（5）蔗糖 20 g/L+豆饼粉2 g/L；（6）蔗糖20 g/L+豆饼粉4 g/L。在最适温度、pH值及最适转速条件下培养36 h后计数。

2 结果与分析

2.1 菌株在不同培养温度条件下生长情况

将在不同温度条件下培养的M2菌株发酵液培养36 h后取样镜检，稀释涂布计数，结果如图1。

从图1中可以看出，该菌的最适培养温度为30℃，在此温度条件下菌数最多。

2.2 菌株在不同pH值条件下生长情况

将不同pH值条件培养的M2菌株发酵液培养36 h后取样镜检，无杂菌稀释涂布计数，结果如图2。

从图2中可以看出，该菌在灭菌前培养基pH值7.5的条件下生长状况最佳。酸或碱性条件下的菌数均受到影响。

2.3 菌株在不同培养转速条件下生长情况

前面确定最适pH值和温度后，设定不同转速梯度进行试验，培养36 h后取样进行稀释涂布计数，结果如图3所示。

从图3可以看出，设定转速180 r/min时，菌生长情况最佳。

2.4 配方优化结果

对6组配方培养的发酵液进行计数结果统计，结果如图4所示。

从图4中可以看出，优化后的配方均提高了发酵液菌数，其中以处理（5）（蔗糖20 g/L+豆饼粉2 g/L）的配方菌数最高，可稳定在90×108cfu/mL。

3 结论与讨论

本研究通过对苜蓿根瘤菌M2进行温度、pH值、转速的选择及发酵配方的优化，得出了该菌培养的最适温度为30℃，培养基灭菌前的最佳pH值为7.5，发酵转速最佳设定为180 r/min，在YMA培养基基础上进行优化后，最适的培养配方为：蔗糖20 g/L，豆饼粉2 g/L，酵母粉0.8 g/L，氯化钠 0.1 g/L，KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCO33.5 g/L。在该条件和配方下，M2的液体发酵的菌数可以稳定在90×108cfu/mL。相对于甘露醇来说，蔗糖和豆饼粉的成本较低，取材和来源广泛，利用蔗糖和豆饼粉极大地提高了产量，降低了生产成本，为大规模工业生产提供了基础。

参考文献：

［1］沈世华，荆玉祥.中国生物固氮研究现状和展望［J］.科学通报，2003，48（6）：532-540.

［2］陈丹明，曾昭海，隋新华，等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的筛选［J］.草业科学，2002，19（6）：27-31.

［3］Zabran H H.Rhizobium-legume symbiosis and nitrogen fixation under severe condition and in arid climate［J］.Microbiol Mol Biol Rev，1999，63：968-989.

［4］马兴祥，刘明春，尹 东.祁连山草原气候和草地资源开发利用［J］.草原与草坪，2000（3）：37-39.

［5］周 敏.中国苜蓿栽培史初探［J］.草原与草坪，2004（1）：44-46.

［6］Zhang Y J，Shen Y X.Development potential and planting mode of alfalfa in farming regions of southern China［J］.Grassland&Turf，2010，41：35-143.

［7］史晓霞，师尚礼，杨 晶，等.豆科植物根瘤菌分类研究进展［J］.草原与草坪，2006（1）：12-17.

［8］师尚礼.苜蓿根瘤菌固氮研究进展及浅评［J］.中国草地学报，2005，27（5）：63-68.

［9］师尚礼.紫花苜蓿根瘤菌研究进展［J］.甘肃农业大学学报，2005，40（2）：262-267.

［10］宁国赞，李元芳，刘惠琴，等.我国豆科牧草根瘤菌选育及应用研究的进展（1981～1988年）［J］.中国草地学报，1989（3）：68-73.