三种冷冻方法对人卵巢组织卵泡形态和凋亡的影响*

赵淑芹　仇雪梅　丁　晨　王　磊　黄淑娟　马兆文

(枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东 枣庄　277100)



三种冷冻方法对人卵巢组织卵泡形态和凋亡的影响*

赵淑芹仇雪梅丁晨王磊黄淑娟马兆文

(枣庄市妇幼保健院生殖医学中心，山东 枣庄277100)

摘要：目的探讨两步法冷冻、玻璃化冷冻和程序化冷冻法冻融人类卵巢组织的冷冻效果，以期探索更优的卵巢组织冷冻方案。方法收集6例人卵巢组织，每例修剪成4块，分别随机分配到两步法冷冻组(A组)、 玻璃化冷冻组(B组)、程序化冷冻组(C组)和新鲜对照组(D组)，组织学分析4组卵泡形态学变化，并通过TUNEL法评估卵泡的凋亡情况。结果两步法冷冻组始基卵泡和初级卵泡的异常形态卵泡率比玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。玻璃化冷冻组始基卵泡异常形态率低于程序化冷冻组(P<0.05)，初级卵泡异常形态率两组差异无统计学意义(P>0.05)。各冷冻组卵巢皮质中始基卵泡的凋亡差异均无统计学意义(P>0.05)。卵巢间质细胞中，两步法冷冻组间质细胞凋亡率较玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05) ，玻璃化冷冻组和程序化冷冻组差异无统计学意义。结论人体卵巢组织冻融后大部分卵泡形态保持正常，两步法冻存效果优于玻璃化冷冻法和程序化冷冻。

关键词：卵巢组织；玻璃化冷冻；两步法冷冻；程序化冷冻；人

卵巢组织的冷冻保存为肿瘤患者，或患有卵巢早衰等其他疾病的患者提供了保存自身生殖内分泌功能及生育能力的可能性。冷冻复苏后的卵巢可进行体外培养，自体移植，或使用辅助生殖技术来帮助不孕的女性。但卵巢组织的冻存策略现都处于探索阶段中，至今还未形成规范的冻存策略。

在冷冻保存技术中，最常用的两种冷冻方法为玻璃化冷冻法与程序化冷冻法。程序化冷冻法最早使用开始于l996年，Hovatta与Newton等首次使用此法冷冻人类卵巢组织[1-2]。而玻璃化冷冻卵巢组织则是最近二十年来的新兴研究方向。并且现在部分文献报道，玻璃化冷冻技术优于程序化冷冻[3]。但是哪一个冷冻方案更适合冻融卵巢，并没有统一定论。因此如何选择冷冻卵巢组织的最佳方案一直是大家讨论研究的热点。

两步法冷冻是简化的程序化冷冻，曾应用于冷冻心脏瓣膜及血管，尚未应用于冷冻卵巢组织。两步冷冻法的主要优点是将繁琐的慢速冷冻过程简化，不仅保留了慢速降温所需的基本条件，还降低了冷冻成本。本实验采用两步冷冻法、玻璃化冷冻法和程序化冷冻法冻存人卵巢组织，通过研究三种冷冻方法对卵巢组织中卵泡的影响探索合适的冷冻卵巢组织策略，并冻融卵巢组织，为下一步卵巢组织移植奠定基础。

1材料和方法

1.1实验材料收集2012年至2013年山东省枣庄市妇幼保健院妇产科6例患者的卵巢组织，均为卵巢良性肿瘤。患者手术时间为月经干净2～5 d期间，取材的卵巢组织术后病理证实处于卵泡期。所有患者均月经规律，且近1年内无激素服用史，术前内分泌6项激素测定均在正常值范围内。实验经枣庄市妇幼保健院伦理委员会批准，标本提供者均签署知情同意书。

1.2分组取非卵巢疾病患者切除的卵巢，用剪刀将卵巢组织与周围结缔组织分离，被剪下的卵巢组织放入盛有10 ml PBS的无菌离心管中置于冰上，立即送至实验室无菌操作台中操作。用眼科剪在培养皿中将卵巢组织的髓质分离。在实体显微镜下将卵巢皮质切成约2 mm左右厚，面积约1.5 cm2大小的组织块4块，分别为两步法冷冻组(A组)、玻璃化冷冻组(B组)、程序化冷冻组(C组)和新鲜对照组(D组)，即同一患者的卵巢组织按上述方法分为4块并随机分配到4组中。D组组织用4%多聚甲醛固定作组织学分析，A、B、C组冷冻保存。所有操作在室温下1h内完成。

1.3实验试剂冷冻液：DMSO、乙二醇(EG)，购自Sigma公司；聚乙二醇(PEG)、牛血清清蛋白(BSA)、蔗糖，购自北京Solarbio公司。培养液：a-MEM液(Gibco公司)、10%胎牛血清(FBS，Gibco公司)、1%胰岛素铁硒传递蛋白等。

1.4组织冷冻与复苏

1.4.1两步冷冻法冷冻及复苏步骤参考Liu等[4]冻存间充质干细胞的方法。将卵巢组织浸入冷冻液(10%DMSO+10%EG+6%PEG+0.5%BSA+0.5 mol/L蔗糖)，4℃10 min后直接放入盛有1 ml冷冻液的2.5 ml冻存管中放入-86℃超低温冰箱(海尔DW-86L728)以1.0℃/min降温至-80℃过夜，第2天投入液氮罐。复苏A组组织时，放入37%水浴1 min后，将冻存管内组织直接浸入10 ml PBS中5 min，再用培养液冲洗3遍。

1.4.2玻璃化冷冻法冷冻液与解冻液配方参照Moniruzzaman等[5]的冷冻配方，为了减少冷冻液的毒性及阻断冰晶的形成，增添大分子冷冻保护剂(PEG6000)和动物源性蛋白[6-7]。平衡液(ES)为7.5%DMS0+7.5%EG+6%PEG+0.5%BSA+0.5 mol/L蔗糖；冷冻液(VS)为15%DMSO+15%EG+6%PEG+0.2%BSA+0.5mol/L蔗糖。解冻液配方：(1)0.5 mol/L蔗糖+10%FBS+α-MEM培养基；(2)0.25 mol/L蔗糖+10%FBS+α-MEM培养基；(3)0.125 mol/L蔗糖+10%FBS+α-MEM培养基。将制备好的卵巢组织块依次浸入ES和VS中室温各平衡10 min。最后浸入盛有0.5 ml VS冷冻液的2.5 ml冻存管10 min后，迅速投入液氮罐中(-196℃)。复苏冷冻组织时取出冷冻管后迅速拧松管口，放人37℃水浴箱中1 min左右至冷冻液溶解。将B组组织依次放入解冻液(1)(2)(3)各5 min，最后用培养液冲洗3遍。

1.4.3程序化冷冻法冷冻方法参考Newton等[2,8]的慢速程序冷冻法：将卵巢组织投入含1.5 mol/L PROH+0.1 mol/L S+10 mg/ml HSA的PBS液中，室温平衡90 min，装入0.5 ml冷冻管中放于程序冷冻仪上，从室温开始以2℃/min降至-7℃，人工植冰，再以0.3℃/min的降温速率降至-30℃，以l0℃/min的降温速率降至-120℃，投入液氮中冷冻保存。复温方法：将冷冻管自液氮罐中取出，置入37℃水浴箱中2～3 min，室温中按含1.0 mol/L PROH、0.5 mol/L PROH的PBS液梯度递减洗脱冷冻保护剂各3遍，将组织移入含5%HSA的PBS液中完成复温。

1.5组织学形态学分析将固定好的组织块脱水透明，石蜡包埋后，4μm 厚连续切片，作HE染色分析。根据Gougeon[9]分类标准分级卵泡。正常卵泡结构为完整的圆形细胞核，核仁清晰及颗粒细胞分布均匀，卵泡基底膜完整。形态异常的卵泡，表现为基底膜不完整，颗粒细胞分散，周围胞质中出现空泡。所有组织块均进行连续切片，为避免卵泡重复计数，每隔10张切片取1张固定，于400倍倒置显微镜(Olympus IX81，日本)下随机观察10个视野，以卵母细胞核仁为标记计数各级卵泡，并计算形态正常卵泡比率。正常形态卵泡比率为：(正常形态卵泡数/正常形态卵泡数+形态改变卵泡数)×100%。

1.6TUNEL检测实验步骤按照产品说明书进行。阳性对照为试剂盒内提供的切片，阴性对照则用蒸馏水替代TdT。结果判定：①200×倒置显微镜下，已凋亡细胞胞核着色为棕黄色或褐色，细胞核染为蓝色的为有活性的细胞。②凋亡阳性始基卵泡：参照Raffaell所述标准，当始基卵泡中卵母细胞染色阳性和(或)超过50%颗粒细胞染色阳性，则记录为凋亡阳性[10]。③参照Kim所述方法，间质凋亡阳性率=染色阳性的间质细胞面积/组织总面积×100%[11]。因窦卵泡与黄体会出现生理性凋亡而影响结果，所以这些结构不包含在细胞凋亡阳性染色计数内。凋亡细胞的比率=凋亡细胞数目/总的细胞数目×100%。

1.7统计学分析使用SPSS 19.0统计学软件分析数据。各组正常与异常卵泡比率及细胞凋亡比率的比较用χ2检验。显著性水平为α=0. 05。

2结果

2.1卵巢组织学评价在光学显微镜下可见，冷冻后的人卵巢组织与冷冻前相比，大多数始基卵泡形态基本保存满意，4组始基卵泡和初级卵泡的异常形态卵泡比率见表1。各组冷冻后始基卵泡和初级卵泡的异常形态卵泡率较新鲜组均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。在各冷冻组间比较，两步法冷冻组始基卵泡和初级卵泡的异常形态卵泡率比较玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。玻璃化冷冻组始基卵泡异常形态率低于程序化冷冻组(P<0.05)，初级卵泡异常形态率两组差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　不同冷冻方案各级卵泡的异常形态率(n，%)

注：*：与新鲜组相比，P<0.05；#：与玻璃化冷冻组和程序化冷冻组相比，P<0.05；△：与程序化冷冻组相比，P<0.05。

2.2卵巢组织细胞凋亡分析TUNEL检测各组卵巢皮质中始基卵泡凋亡情况发现，各组冷冻后凋亡发生率较新鲜组均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。在各冷冻组间两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。对于卵巢间质细胞凋亡分析可见，各冷冻组间质细胞凋亡发生率较新鲜组明显增加，差异有统计意义(P<0.05)；在各冷冻组间比较，两步法冷冻组间质细胞凋亡率较玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。玻璃化冷冻组和程序化冷冻组间差异无统计学意义。见表2。

表2　各冷冻组及新鲜组始基卵泡和间质细胞凋亡发生率

注：*：与新鲜组相比，P<0.05；#：与玻璃化冷冻组和程序化冷冻组相比，P<0.05。

3讨论

卵巢组织冷冻是保护女性病人生殖内分泌功能的一种重要方式。目前常用的卵巢组织冷冻方法是玻璃化冷冻和程序化冷冻法，但哪一个冷冻方案更适合冻融卵巢，并没有统一定论。Keros等[13]发现玻璃化冷冻比程序化冷冻能更好的保存卵巢组织的镜下形态，尤其是卵巢基质细胞。但也有文献报道程序化冷冻卵巢组织的冷冻效果比玻璃化冷冻法更好[14]。寻找理想的卵巢组织冷冻保存方案一直是各科研工作者努力研究的方向。本研究探讨了一种新的冷冻方案即两步法冷冻卵巢组织的冷冻效果，并和玻璃化冷冻法和程序化冷冻法进行了比较。

本实验发现两步冷冻法始基卵泡和初级卵泡的异常形态卵泡率比较玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，对卵泡组织形态的保存优于另外两种方法。玻璃化冷冻效果不如两步冷冻法可能是因为玻璃化冷冻液密度较大，不能迅速渗入大块组织，整块组织细胞内的水分不能均匀形成玻璃化状态。尤其对于结构复杂的组织，降温速率快使细胞内水分无法达到平衡状态引起细胞内冰晶形成，高浓度的冷冻保护剂也增加了细胞内毒性损伤以及渗透性损伤。而两步冷冻法中冷冻保护剂浓度较低，降低了溶质损伤与细胞毒性损伤；低浓度冷冻保护剂在慢速降温过程中，使细胞外冰晶形成早于细胞内，从而细胞外环境中水分减少渗透压升高，胞内脱水，防止了胞内冰晶形成[15]。

本研究中进一步分析了始基卵泡和卵巢间质细胞的凋亡情况。凋亡是细胞程序化的死亡，细胞自身调控通过激活细胞核内核酸内切酶，而引起小分子DNA断裂。TUNEL检测则是利用这种DNA片段来检测凋亡细胞，从而评估卵巢组织冻融前后的损伤情况[16]。在本实验研究中，各冷冻组卵巢皮质中始基卵泡凋亡情况差异均无统计学意义，对于卵巢间质细胞，两步法冷冻组间质细胞凋亡率较玻璃化冷冻组和程序化冷冻组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。研究结果说明两步冷冻法能更好的保护卵泡周围的基质细胞。

总之，本研究结果显示，卵巢组织能够很好的耐受冷冻损伤，通过冷冻保存可以保存大部分卵泡活性。两步冷冻法比玻璃化冷冻法及程序化冷冻法冷冻更有利于卵泡正常形态的维持并降低间质细胞的凋亡，从而为卵巢组织冷冻提供了新的方案。

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Effects of three different freezing methods on the follicularmorphology and apoptosis of human ovarian tissues

ZHAOShu-qinQIUXue-meiDINGChenWANGLeiHUANGShu-juanMAZhao-wen

(Maternal and Child Health Care Hospital of Zaozhuang，Zaozhuang 277100，China)

Abstract:Objective：To compare the cryopreservation effect of two-step freezing, vitrification and slow programmed cooling in order to explore a more effective method for human ovarian tissue cryopreservation. Methods：6 samples of adult ovarian tissue were collected and divided into 4 groups randomly：the two-step freezing group, the vitrification group, the slow programmed cryopreservation group and the fresh group．Stromal cells and follicles in ovarian cortical tissues were analyzed by histological analysis．Follicles apoptosis were analyzed by TUNEL assay． Results：The two-step freezing group showed a significant lower percentage of abnormal morphology of follicles (Primordial and Primary) than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group. In the percentage of abnormal morphology of primary follicles，the vitrification group showed no significant differences with the slow programmed cryopreservation group, and showed a significant lower percentage of abnormal morphology of primordial follicles than the slow programmed cryopreservation group. In the percentage of apoptotic follicles, there was no significant difference among three cryopreservation groups (P>0.05)．In ovarian stroma cells, the two-step freezing group showed a significant lower apoptotic percentage than the vitrification group and slow programmed cryopreservation group, and there was no significant difference between the vitrification group and the slow programmed cryopreservation group.Conclusion：Morphology of most follicles can remain normal after human ovarian tissues are frozen and thawed, and the two-step freezing method is better than vitrification and slow programmed cooling.

Key words:ovarian tissue；vitrification；two-step freezing；slow programmed cryopreservation；human

(收稿日期2015-12-18)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.03.001

中图分类号：R711

文献标识码：A

文章编号：1004-7115(2016)03-0241-04

作者简介：赵淑芹(1966-)，女，主任医师，硕士，主要从事生殖医学临床和研究工作。

*基金资助：山东省科学技术发展计划(2009GG20002079)；山东省自然科学基金(ZR2015HM067)。