超声波提取地龙抗血栓部位的工艺研究

郑顺亮，刘东明，王思瑶

（牡丹江友搏药业有限责任公司，黑龙江牡丹江157013）



超声波提取地龙抗血栓部位的工艺研究

郑顺亮，刘东明，王思瑶

（牡丹江友搏药业有限责任公司，黑龙江牡丹江157013）

摘要：通过提取方式选择和正交设计法对地龙的抗血栓部位进行超声波提取，以纤溶酶活性和干膏率为指标，分别对料液比、提取温度、提取时间等因素进行考察，优选出最佳工艺条件为：以水为提取溶剂，料液比1∶12/1∶10，提取温度25℃，提取时间40min；验证试验表明工艺稳定可行。

关键词：地龙；抗血栓部位；超声波提取；纤维蛋白平板法；正交试验

地龙（Pheretima）为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi （Michaelsen）和栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥全体[1 ]。地龙是一味重要的动物药材，临床上常被用来治疗心脑血管疾病、高热惊厥、哮喘等[2]。地龙中含有多种活性成分[3-7]，包括具有抗血栓、抗凝活性的蛋白质、多肽、酶类成分（酶类主要包括蚯蚓纤维蛋白溶解酶Earthworm fibrinolytic enzyme、蚓激酶Lumbrokinase等），还含有核苷酸、脂类、微量元素等其他成分，这些成分在地龙的应用中起着十分重要的作用。本实验采用纤维蛋白平板法来检测地龙中的纤溶酶活性，并以纤溶面积和干膏率为指标，优化和确定超声波提取地龙抗血栓部位的提取工艺。友搏药业现已配备产业化外循环超声提取设备（一吨罐），本工艺研究可为地龙的产业化研究及综合开发利用奠定基础，同时为公司新产品的开发起推动作用。

1　实验部分

1.1材料与仪器

地龙药材（广地龙）由牡丹江友搏药业有限责任公司提供，产地广西。

5%纤维蛋白原溶液（溶于0.1mol·L-1磷酸缓冲液pH值为7.4），20μ·mL-1凝血酶溶液（溶于0.1 mol·L-1磷酸缓冲液pH值为7.4）；凝血酶（上海生物化学制药厂），纤维蛋白原（上海莱士血制品有限公司）；乙醇（A.R.），蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

RE-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SC-3610离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；RE-52旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；BGZ146电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DSY-1-6孔电热恒温水浴锅（北京国华医疗器械厂）；FE20K型PH计（METTLER TOLEDO公司）；YP3001N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；平皿（φ9cm）若干；PSH-525恒温箱（重庆试验设备厂）；游标卡尺（SANTO公司）。

1.2纤维蛋白平板的制备[ 8 ]

在平皿内加9mL纤维蛋白原溶液，再加1mL凝血酶溶液，立即打旋混匀大约10s，在平皿盖上衬以滤纸，在水平处放置30min，4℃冰箱中保存备用。

1.3纤溶酶活性的测定方法[ 9 ]

将20μL地龙待测液滴加到纤维蛋白平板上，每点间距离不得小于1.5cm，在另一侧滴加20μL生理盐水作为对照。将平板平置于湿盒内，放入37℃恒温箱中培养6h，观察有无溶解圈，并用卡尺测定溶解圈的直径，根据下式计算溶解圈面积（纤溶面积），以纤溶面积评价纤溶酶活性（面积越大，表示纤溶酶活性越强）。

纤溶面积（mm2）=[（长径+短径）/4]2×π

1.4干膏率的测定方法

精密吸取适量地龙提取液置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干溶剂，转移至干燥箱中105℃干燥3h，取出置干燥器中放凉，称定，得干膏物重，并根据下式计算干膏率。

干膏率（%）=（干膏物重/地龙生药量）×100%

1.5提取工艺设计

首先，对超声波提取地龙抗血栓部位的提取溶剂、方式进行考察，根据试验结果选择合适的影响因素再进行正交试验，最后根据筛选得到的最佳工艺提取3批样品进行验证。

1.6提取方式的选择-提取液的制备

水煎煮法：将地龙100g加水浸泡30min，煎煮提取2次（10倍量，每次90min），过滤，合并滤液。

乙醇回流法：将地龙100g加70%乙醇浸泡30min，加热回流提取2次（10倍量，每次90min），过滤，合并滤液。

水超声提取法：将地龙100g加水浸泡30min，超声提取2次（10倍量，每次40min），过滤，合并滤液。

乙醇超声提取法：将地龙100g加70%乙醇浸泡30min，超声提取2次（10倍量，每次40min），过滤，合并滤液。

以上4种不同提取方式得到的滤液均分别以4800r·min-1离心30min，上清液定容后取适量减压浓缩（55～60℃）至每毫升药液相当于2.0g生药（即2.0g生药/mL），备用。

2　结果与讨论

2.1地龙提取方式的选择

以纤维蛋白平板法的纤溶面积为指标，考察和优选地龙的提取方式。

按“1.3纤溶酶活性的测定方法”，精密吸取“1.6提取方式的选择-提取液的制备”项下的4种地龙提取浓缩液各20μL，分别滴加于同一纤维蛋白平板上，于37℃培养6h，测定纤溶面积，结果见表1。

表1　4种提取方式试验结果Tab.1　Results of the four extraction methods

结果表明，地龙的水超声提取法优于其他3种方法，所以选择以水为溶剂、超声提取法提取地龙抗血栓活性部位。

2.2地龙水超声波提取的工艺优选

根据“2.1”项下地龙提取方式试验结果，以水为提取溶剂进行超声波提取，均提取2次，分别以料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）为影响因素，以干膏率和纤溶面积为考查指标，进行L9（34）正交试验对提取条件进行优选。因素水平、试验结果及方差分析结果分别见表2～4。

表2　L9（34）正交试验水平因素Tab.2　Orthogonal test of L9（34）

表3、4结果表明，对地龙干膏率影响的主次因素为提取温度（C）＞提取时间（B）＞料液比（A），其中提取温度的影响具有高度显著性（P小于0.01），提取时间和料液比没有显著性差异，最佳工艺为A2B2C3；对纤溶面积影响的主次因素为提取温度（C）＞料液比（A）＞提取时间（B），其中提取温度的影响具有高度显著性（P小于0.01），料液比的影响具有显著性（P小于0.05），提取时间没有显著性差异，最佳工艺为A3B2C1。考虑到纤溶面积指标在地龙抗血栓部位超声波提取工艺中的重要性，并结合生产成本、时间、效率等因素，优选工艺为A3B2C1，即超声波提取地龙抗血栓部位的优选工艺条件为以水为提取溶剂，料液比（提取两次：第一次1∶12，第二次1∶10），提取温度为25℃，每次提取时间为40min。

在以上优化工艺条件下重复试验进行验证，地龙超声波提取的干膏率为11.23%（±1.24%，n=3）、纤溶面积为423.5mm2（±2.73%，n=3），验证试验结果表明工艺稳定可行。

表3　L9（34）正交试验结果Tab.3　Result of orthogonal test of L9（34）

表4　方差分析Tab.4　Analysis of variance

2.3讨论

提取溶剂和提取方式是决定地龙抗血栓部位纤溶活性的2个重要因素，因此，本实验首先考察了以乙醇、水为提取溶剂，超声提取和加热（回流）提取分别对地龙进行提取考察，结果表明加热提取（高温）破坏地龙中的纤溶酶活性成分而无纤溶作用，而以水为溶剂超声波提取的地龙纤溶酶活性显著优于以乙醇为提取溶剂。

纤维蛋白溶解活性（纤溶酶活性）的测定方法是评价药物纤溶活性和筛选抗血栓部位的重要手段。试验中，同时采用过平板法和加热平板法来测定地龙样品的纤溶酶活性，结果发现平板法较加热平板法敏感，所以本试验选择平板法测定纤溶面积。

大生产过程中对中药材的提取基本上都是采用提取两次，在试验过程中，考察了地龙药材的超声波第3次提取，其第3次提取的干膏率占总干膏率的3.52%、纤溶面积（样品浓度：4.0g生药/mL）仅为38.3mm2，表明地龙超声波提取两次已基本提取完全，考虑大生产的成本、效率等因素，可不进行第3次提取。

3　结论

本试验采用超声波提取技术，应用超声波能在液体介质中传播的性质和超声波特有的“空化效应”，快速有效地提取地龙药材中的有效成份。与传统的水煎、回流相比，超声波提取具有以下优点：（1）提取温度低：超声波提取中药材有效成份的最佳温度为20～60℃，对热不稳定、易水解或氧化的有效成份具有保护作用，同时节省能耗；（2）提取时间短：通常在20～40min即可获得最佳提取效果，较传统水煎、回流的提取方法缩短提取时间；（3）提取效率高：超声波独具的物理特性促使动植物细胞组织破壁或变形，使有效成分提取更充分，提取率与传统提取方法相当或更高；（4）适应性广：超声波提取中药材不受成份极性、分子量大小的限制，适用于绝大数种类中药材和各类成份的提取。

由于地龙的有效成份酶类（如纤维蛋白溶解酶、蚓激酶）等为热敏成份，高温情况下易被破坏降解，用超声波提取技术进行常温或低温提取，可以有效保留地龙的抗血栓活性成分，从而提高产品质量，保证产品疗效，并适合大生产的需要。本试验通过提取方式选择和正交实验，优化和确定了超声波提取地龙抗血栓部位的工艺条件，对于今后开发利

用地龙及相关新产品的开发有重要的意义。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版一部）［S］.北京:中国医药科技出版社, 2010.113.

［2］王本祥.现代中药药理学［M］.天津:天津科学技术出版社,1997. 1104.

［3］白凤瑞,吕志阳.药用地龙的研究进展［J］.黑龙江医药,2010,23. 610-613.

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［5］唐鼎,凃乾,李娟,等.药用地龙的药理作用和临床研究进展［J］.中国药师, 2015, 18（6）: 1016-1019.

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［7］王枚博,夏晶,王欣美,等.金银花等10种中药材中15种无机元素分布规律及其相关性研究［J］.中国药学杂志, 2012, 47（8）: 620-625.

［8］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社, 1993 : 617-618.

油田化学

Study on extraction of anti-thrombotic site from Pheretima by ultrasonic method

ZHENG Shun-liang，LIU Dong-ming，WANG Si-yao
（Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co.,Ltd., Mudanjiang 157013, China）

Abstract：In this study，the ultrasonic extraction of anti-thrombotic site from Pheretima was optimized by extracting mode and orthogonal design test using the fibrinolysin activity and ratio of dry extraction as index. Ratio of material to liquid, extraction temperature, extraction time and other factors were investigated. The optimum extraction condition has been established as follows: using water as extraction solvent, ratio of material to liquid 1∶12 / 1∶10, extraction temperature 25℃, extraction time 40min. Validation test showed that the optimized process is stable and high efficient.

Key words：Pheretima；anti-thrombotic site；ultrasonic extraction；fibrin plate method；orthogonal experiment

作者简介：郑顺亮（1984-），男，浙江温州瑞安，（制药）工程师、硕士，研究方向：天然产物的研究与开发。

收稿日期：2016-01-30

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160374

中图分类号：R961

文献标识码：A