辣椒抗炭疽病主效基因的定位及标记开发

刘议蔚 张正海 曹亚从 赵 红 王立浩 张宝玺

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

辣椒抗炭疽病主效基因的定位及标记开发

刘议蔚 张正海 曹亚从 赵 红 王立浩 张宝玺*

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

以高抗炭疽病的辣椒材料PBC932（Capsicum chinense）为父本，以感病辣椒材料77013（Capsicum annuum）为母本和回交亲本，获得包含220个和129个单株的BC3S1和BC4S1群体材料，通过对各群体进行尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）抗性鉴定和SNP（KASPar）分子标记分析，发现UN27353_1781标记与辣椒绿熟期炭疽病抗性基因AnRGO5紧密连锁，遗传距离为2 cM。进一步利用标记UN27353_1781对BC4S2群体124个单株进行分子标记分型，选择准确率达92.9%，表明该标记可有效用于辣椒抗炭疽病分子标记辅助育种。

辣椒；炭疽病；抗性；尖孢炭疽菌；KASPar标记

辣椒炭疽病是由半知菌亚门刺盘孢属（Colletotrichum spp.）内的几个种引起的全球性真菌病害，目前在世界各地均有发生，高温高湿的条件下发病尤为严重（Hartman & Wang，1992；Voorrips et al.，2004），严重损害了辣椒的产量和商品价值。在我国，目前研究的炭疽病病菌主要有4种：尖孢炭疽菌（C. acutatum）、红色炭疽菌（C. gloeosporioides）、黑点炭疽菌（C. capsici）和黑色炭疽菌（C. coccodes）。据相关统计，我国炭疽病引起的辣椒减产一般为13%～18%，严重时可达50%（林清 等，2005）。培育抗炭疽病品种是保证辣椒正常生产的重要措施，而利用分子标记辅助育种是既经济又高效的途径之一。

Mahasuk等（2016）利用PBC80衍生群体对炭疽病抗性相关QTL进行研究，定位到3个与辣椒成熟期抗性相关的主效QTL：RA80rP2、RA80rP3.1和RA80rHP1，且均被定位到了4号连锁群相同位点，两侧最近的SNP标记为BACSNP-4-63和BACSNP-4-60，这两个标记相距17 cM，遗传距离稍远，在育种应用中受到一定的限制。

此前，中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒课题组利用尖孢炭疽菌对抗源材料PBC932绿果期的抗性基因进行了相关QTL定位，将主效基因AnRGO5初步定位到辣椒P5染色体末端InDel标记和HpmsE116标记之间，这两个标记间的遗传距离为9.6 cM（Sun et al．，2015）。由于SNP标记具有数量多、稳定性强、多态性丰富等特点在标记开发中越来越受到重视，目前基于SNP标记开发的KASPar标记覆盖了辣椒整个基因组。该遗传定位为进一步开发紧密连锁的SNP标记奠定重要基础。

本试验利用抗病亲本PBC932和感病亲本77013杂交并回交获得BC3S1和BC4S1群体，并对回交群体进行炭疽病抗性鉴定，利用KASPar标记对绿果期主效抗性基因区段的连锁图谱进行加密，找到与辣椒绿果期抗炭疽病主效基因紧密连锁的分子标记，旨在为辣椒抗炭疽病辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试辣椒材料：2015年5月至2016年1月期间，以高抗炭疽病材料PBC932（Capsicum chinense）（亚洲蔬菜研究发展中心王添成博士馈赠）为父本，以感病材料77013（Capsicum annuum）（本所培育）为母本进行杂交，以77013为父本回交获得BC3和BC4群体，利用初定位区段InDel标记和HpmsE116标记进行分子标记辅助选择（MAS），同时结合表型抗性鉴定，从BC3和BC4群体中选出抗病杂合的单株BC3-1和BC4-17，再分别自交获得包含220个单株的BC3S1群体和129个单株的BC4S1群体，两个群体定植于廊坊秋季21号日光温室。供试病原菌为尖孢炭疽菌（菌株Coll-153），由本所辣椒课题组分离鉴定。

1.2 病原菌接种

人工接种采用针刺法（Pin-pricking inoculation），参照Yoon和Park（2001）的方法，略有改动。将采收的绿熟期果实洗净，用70%的酒精喷洒在果实表面进行灭菌处理，用微量注射器（Hamilton PB600-1，Repeating Dispenser，Reno，NV，USA）在果实表面刺入深1 mm、直径0.4 mm的伤口，注入1 μL浓度为5×105个·mL-1分生孢子悬浮液，根据果实大小每个果实接种2～3个点，每个单株设置3次重复；将接种后的果实接种点向上放置在铺有湿润灭菌滤纸的塑料箱中，初期为加快病原菌侵染可提供相对高湿的环境，用保鲜膜将塑料箱密封，置于26 ℃培养箱中暗培养2 d，湿度保持在98%以上；为减少后期烂果，2 d后揭开保鲜膜，盖上塑料箱盖子暗培养5 d，湿度降至90%左右。

1.3 炭疽病抗性分析

以PBC932、77013和F1单株作为对照，对BC3S1和BC4S1群体的接种果进行抗病性鉴定。抗性鉴定指标为平均病斑直径（O）。病斑直径的测量标准为没有发病的接种点病斑直径记为0 mm，发病的接种点病斑直径为病斑横、纵径的平均值。通过将群体的病斑数据与两个亲本及F1的病斑数据进行方差分析等比较，最终确定抗病性划分标准为：抗病（R）：0 mm≤O≤7 mm；中抗（MR）：7 mm＜O≤12 mm；感病（S）：O＞12 mm。

平均病斑直径（O）=∑病斑直径/接种点数

1.4 基因组DNA提取

采集两个群体及对照的全部个体单株嫩叶，冷冻抽干磨成粉末，采用改良CTAB法提取干样的全基因组DNA（Wang et al．，2005），1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，用Biospec-nano微量分光光度计检测所提DNA质量和浓度。提取后的DNA置于深孔板中，硅胶盖密封置于-20 ℃保存备用。

1.5 KASPar反应体系建立及引物筛选

本试验采用的KASPar分子标记由本所辣椒课题组同法国农业科学研究院合作开发。KASPar标记含有3条引物序列：A1、A2、C，其中C为反向互补序列，A1和A2只存在末端的SNP位点差异，在A1、A2的5′端分别连接各自的接头序列：5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′、5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，此两端接头序列能与Master Mix里带有荧光的序列互补配对，

配对后会激发荧光。

KasPar引物预混体系（100 μL）为：位点特异引物A1 12 μL，位点特异引物A2 12 μL，共用引物C 30 μL，ddH2O 46 μL。PCR扩增体系（约4 μL）为：DNA（5 ng·μL-1）2 μL，2×KASPar Mix 2 μL，KasPar引物预混液0.055 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 15 min；94 ℃ 20 s，61 ℃（每个循环降低0.6 ℃）1 min，9个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃1 min，26个循环；94 ℃ 20 s，57 ℃ 1 min，9个循环。利用Roche 480Ⅱ荧光定量仪读取PCR产物的荧光值，统计分型结果：分型结果与亲本PBC932相同的记为“a”，与77013相同的记为“b”，杂合位点记为“h”，未识别的记为“_”，分析筛选出在亲本间具多态性的KASPar引物。

1.6 多态性标记分析群体及遗传连锁图谱的构建

用亲本间存在多态性的KASPar引物对BC4S1群体进行分析，统计引物在群体中的荧光分型结果。结合病斑数据和标记分型数据，利用JoinMap 4.0软件构建遗传连锁图谱，再结合MapQTL 6.0软件分析绿熟期主效基因与分子标记位点间的连锁关系，两个软件中LOD最小阈值均选择3.0。

2 结果与分析

2.1 辣椒炭疽病抗性遗传分析

抗病亲本PBC932及F1全部表现为抗病，77013全部表现为感病，抗病性表现为显性遗传。BC4S1群体共接种129个单株，其中21株表现为抗病，55株表现为中抗，53株表现为感病；BC3S1群体共接种220个单株，其中55株表现为抗病，38株表现为中抗，69株表现为感病，其余58株因绿熟果数量不足未获得数据，抗病与中抗单株均属于抗炭疽病植株，两个群体绿熟期抗感植株的分离比例均为9∶7（表1），两个群体抗感单株卡方检测的结果表明，辣椒绿熟期抗性至少受2对以上显性基因控制。

表1 辣椒绿熟期尖孢炭疽菌抗性遗传分析

2.2 辣椒绿熟期炭疽病抗性遗传定位

在初定位的区段内利用已有的SNP标记共筛选了120个KASPar标记。其中10个KASPar标记（表2）在PBC932和77013两个亲本间存在多态性，多态性比例为12.20%。

利用10个多态性KASPar引物分析BC4S1群体的129个单株，统计数据后，利用JoinMap 4.0软件在LOD≥3、步长为0.5的前提下构建遗传连锁图谱，再结合BC4S1群体的表型病斑数据，利用MapQTL 6.0软件在加密的初定位区段内对绿熟期主效基因AnRGO5进行进一步定位分析，发现绿熟期主效基因位于相距6.8 cM的UN27353_1781和UN32931_776两个侧翼SNP标记之间，UN27353_1781标记与AnRGO5基因遗传连锁距离为2 cM（图1、2）。

2.3 辣椒绿熟期炭疽病抗性遗传分子标记的验证及应用

利用UN27353_1781标记对BC3S1群体220个单株进行分子标记验证，BC3S1群体除了10株与表型鉴定结果不相符外，其他都与鉴定结果相一致。再用UN27353_1781标记对BC4S2群体的124个单株进行抗病性分析，共有14个抗病纯合单株；对筛选出的14个单株进行抗病性鉴定，除了1株不抗病外，其他13株都抗病，准确率达到92.9%。验证结果表明：UN27353_1781标记的鉴定效率较高，可以进行快速鉴定，有效用于辣椒抗炭疽病分子标记辅助选择育种。

表2 与辣椒绿熟期抗炭疽病主效基因紧密连锁的KASPar标记信息

图1 KASPar引物（UN27353_1781）在BC4S1群体（129株）中的荧光分型结果

图2 AnRGO5基因的遗传连锁图谱

3 结论与讨论

截至目前，与辣椒抗炭疽病相关QTL定位的报道较多（刘建萍 等，2006；Lin et al．，2007；马荣群 等，2008；Mahasuk et al．，2009；Kim et al．，2010），Lin等（2007）研究辣椒材料0038-9155（由PBC932衍生）对尖孢炭疽菌的抗性遗传，发现绿熟期的抗性由两个互补的显性基因共同控制，红熟期的抗性由2个重叠的隐性基因控制，且这两个时期的抗性基因是相互独立的；Mahasuk等（2016）利用PBC932衍生群体进行了炭疽病抗性相关QTL研究，将绿熟期和红熟期的两个QTL都定位到了2号染色体的相同位点，位于CAP_T39318_0_1_1042和CAP_T22290_0_1_429两个SNP标记之间，而本试验将绿熟期的主效基因定位在5号染色体末端，尽管选用的抗性材料都是PBC932，但病原菌种类和致病性不同，炭疽病病症评价方法也不同，这些都会影响其产生不同的抗性机制。由此可见，辣椒炭疽病抗性受病原菌致病型（不同的诱导因子）、果实成熟期（不同的抗性基因）、接种方法（不同的防御机制）、抗性材料的不同而存在差异，其遗传机制相对较为复杂（Lin et al．，2002；Pakdeevaraporn et al．，2005；Kim et al．，2007；Mahasuk et al．，2009；Yoon et al．，2009）。

目前已获得的与炭疽病抗性紧密连锁的标记并不多，本试验在前人研究的基础上找到1个与AnRGO5紧密连锁的侧翼KASPar分子标记UN27353_1781，遗传图距为2 cM。由于KASPar标记简便、高效，具有很强的灵活性和实用性，为进一步筛选与抗炭疽病紧密连锁的标记创造了可能，同时也为下一步精细定位及克隆AnRGO5基因奠定了基础。

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Mapping of Major QTLs Resistant to Anthracnose（Colletotrichum acutatum）in Pepper（Capsicum spp.）and Marker Development

LIU Yi-wei，ZHANG Zheng-hai，CAO Ya-cong，ZHAO Hong，WANG Li-hao，ZHANG Bao-xi*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

BC3S1and BC4S1populations containing 220 individuals and 129 individuals derived from crossing PBC932（Capsicum chinense）highly resistant to Anthracnose as male parent and susceptible 77013（Capsicum annuum）as female and recurrent parent were indentified with Colletotrichum acutatum resistance and analysized by SNP（KASPar）molecular marker．The results discovered that UN27353_1781 marker was closely linked to Anthracnose resistant AnRGO5 gene during green ripe stage．Their genetic distance was 2 cM．Marker UN27353_1781 was further verified in 124 individuals from BC4S2population. The selection accuracy reached 92.9%，indicating this marker could be effectively used in pepper marker-assisted breeding for Anthracnose resistance.

Capsicum；Anthracnose；Resistance；Colletotrichum acutatum；KASPar marker

刘议蔚，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：liuyiwei08@126.com

*通讯作者（Corresponding author）：张宝玺，研究员，硕士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：zhangbaoxi@caas.cn

2016-07-05；接受日期：2016-09-04

国家自然科学基金项目（31572121），中国农业科学院创新工程项目（CAAS-ASTZP-ZVFCAAS），农业部大宗蔬菜产业技术体系项目（CARS-25）