60Coγ射线照射对血管内皮细胞生物学作用的影响

胡舜英，高雅晶，赵晓腾，陈韵岱*，周平坤

(1解放军总医院心血管内科，100853 北京；2军事医学科学院放射与辐射研究所北京市放射生物学重点实验室，100850 北京)

放射性心脏病与心脏临近部位肿瘤如淋巴瘤、乳腺癌、食管癌、胸腺瘤及肺癌等的放射治疗有关，是肿瘤患者远期预后的重要影响因素，目前尚无有效防治措施[1]。血管内皮细胞是覆盖于血管内膜的单层细胞，若其出现物化损伤或功能紊乱可导致多种疾病的发生[2,3]。血管内皮细胞损伤在辐射导致心血管疾病的发生机制中起着关键作用，血管内皮细胞是放射性心脏病重要的射线损伤靶细胞[4]，因此了解血管内皮细胞的放射损伤及修复机制对于防治放射性心脏病的发生发展有着重要的临床意义。DNA是生物细胞中的遗传物质，维持细胞正常结构和功能对细胞增殖、细胞周期起着至关重要的作用，然而它也是生物细胞中易受辐射损伤的敏感分子，放射可造成细胞或组织遗传物质的结构损伤，细胞若不能及时正确修复这些损伤，就可造成基因组序列的缺失和基因突变，甚至出现细胞死亡、恶变等生物学后果。本研究利用60Coγ射线对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)进行照射，建立HUVEC辐射损伤模型，观察γ射线照射对HUVEC增值及细胞周期的影响，着重研究HUVEC受照射后 DNA分子的损伤及修复机制，明确了DNA修复相关蛋白γH2AX 和 DNA蛋白激酶(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA-PKcs)在HUVEC受照射后的表达变化，为进一步明确60Coγ射线照射导致HUVEC DNA损伤及修复机制奠定基础，从而为放射性心脏病发病机制研究及防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HUVEC购自美国模式菌种收藏中心(American type culture collection，ATCC)，高糖达尔伯克氏必需基本培养基(dulbeccos minimum essential medium，DMEM;Sigma公司，美国)、新生胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；Hyclone公司，美国)，胰蛋白酶(Amresco公司，美国)。其他试剂均为北京化学试剂公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HUVEC在含10%FBS的高糖DMEM中、37℃、5% CO2培养箱培养。

1.2.2 生长曲线与克隆形成实验 取生长状态良好的对数期细胞，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液进行60Coγ射线照射，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所60Coγ射线放射源进行照射，照射剂量分别为0，1，2，4，6 Gy。照射后立即以3×103个/ml浓度接种于24孔板进行常规培养，每个照射剂量3个平行孔，接种后第2天起取各剂量孔计数，连续6 d，绘制细胞生长曲线图。另外，照射后的细胞以递增密度梯度接种于60 mm培养皿中连续培养12 d，期间更换培养基1或2次。之后以预冷的75%乙醇固定细胞30 min，Gemsia染料染色 30 min，显微镜下计数每个培养皿>50个细胞的克隆数。计算克隆形成率：各皿克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 对数期细胞给予4 Gy照射后，于1,2,4,8,12,24 h后收集细胞，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)洗两遍后75%预冷乙醇-20℃固定>24 h，弃去固定液后用0.5 ml PBS重悬细胞，加入终浓度50 mg/L的核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)37℃温浴30 min，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.4 中性单细胞凝胶电泳(彗星电泳) γ射线照射细胞后，分别于照射后15 min，1，2，4 h收集细胞，以PBS重悬细胞至浓度为5×105个/ml。取80 μl 1%正常熔点的已融琼脂糖胶(PBS配制)滴在磨砂玻片上，盖上盖玻片4℃、15 min凝固后取下盖玻片滴加含10 μl细胞悬液的60 μl、0.65%低熔点琼脂糖胶(PBS配制)，盖上盖玻片4℃、15 min凝固后再滴加80 μl、0.65%低熔点琼脂糖胶凝固后，放入预冷的中性细胞裂解液[氯化钠(NaCl) 2 mol/L,乙二胺四乙酸二钠(edetate disodium，Na2EDTA)30 mmol/L,三羟甲基氨基甲烷(trihydroxymethyl aminomethane，Tris)10 mmol/L，十二烷基肌氨酸钠1%，聚乙二醇辛基苯基醚(octyl phenoxy poly ethoxy，Triton-X100)1%，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)10%，pH 8.2～8.5]4℃，2 h裂解细胞，用0.5%Tris-硼酸电泳缓冲液(tris-boric acid-EDTA，TBE)，pH 8.2～8.5，4℃，浸没洗涤2～3次，每次1 h，以20 V、20 mA电流进行8 min电泳，PI(2 mg/L)染色15 min，荧光显微镜观察拍照，casp软件分析细胞拖尾变化。

1.2.5 蛋白质印迹法(Western blot) 照射后收集不同时间点细胞，蛋白裂解液提取细胞总蛋白，用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)测定蛋白浓度，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)后转移蛋白至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，1∶1000稀释度一抗孵育2～3 h(室温)或过夜(4℃)，TBST(tris buffer solution Tween)缓冲液洗涤后，1∶2000～1∶4000稀释度的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育45 min后暗室压片显影。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 60Coγ射线照射对HUVEC增殖的影响

HUVEC经0，1，2，4，6 Gy剂量照射后，连续观察6 d，结果表明随着照射剂量增加，细胞生长速度锐减(图1A)。相比未照射细胞，照射后细胞克隆形成数量和集落大小均随照射剂量增加而明显减小，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01；图1B)。

图1 γ射线照射对细胞增殖的影响

2.2 60Coγ射线导致HUVEC细胞周期阻滞

采用 4 Gy γ射线照射HUVEC细胞，分别在照射后4，8，12，24 h观察不同细胞周期的细胞比例，结果显示，相比未照射细胞，照射后24 h内， G2/M期细胞比例逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.01;图2)。

图2 γ射线照射对细胞周期的影响

2.3 60Coγ射线致细胞DNA双链断裂损伤与修复情况

中性单细胞凝胶电泳(彗星电泳)结果显示，60Coγ射线4 Gy照射后，彗星尾矩延长，在照射后15 min 达到峰值，表明血管内皮细胞经照射后出现明显的DNA双链断裂损伤，随着细胞开始修复，彗星尾部长度达到峰值后开始减小，DNA进行修复(图3)。4 Gy照射后，H2AX磷酸化在15 min处升高，1 h时达到峰值，随后下降，在8 h再达到一个较小的峰值(图4)。而DNA PKcs2056位点的磷酸化15 min明显升高，4 h后缓慢的去磷酸化，呈先升高后降低的趋势(图5)。

3 讨 论

乳腺癌、何杰金氏病以及其他胸部肿瘤的综合治疗方案中， 放射治疗显著改善了患者疾病相关的预后，然而，放射治疗可导致心脏并发症发生，包括冠状动脉疾病、心力衰竭、瓣膜病、心包疾病、传导异常以及心源性猝死。放射治疗所致的心血管并发症大多出现在放疗后10年甚至更长时间，已成为患者非肿瘤本身死亡的主要原因[5]。放射性心脏病机制研究中,研究人员认为毛细血管内皮细胞是射线损伤的靶细胞,心肌细胞的变性及心肌纤维化是继发于内皮细胞受损后的心脏微循环障碍所致[4,6]。DNA是生物细胞中易受辐射损伤的敏感分子,DNA复制在细胞增殖、细胞周期进展中起着关键作用，维持正常结构和功能是细胞正常生长和代谢的基础。

图3 DNA双链断裂彗星电泳图

图4 γ射线照射对γH2AX表达的影响

图5 γ射线照射对DNA PKcs 2056位点磷酸化的影响

本研究结果表明，60Coγ射线照射对血管内皮细胞增殖有明显的抑制作用，并且抑制率与放射剂量呈正相关。而早期研究报道，低剂量射线刺激下，细胞内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体KDR表达明显增加，从而促进细胞增殖[7]。张晓启等[8]推测细胞来源不同，其对辐射的耐受性也会有所差异，并且不同周期时相的细胞对辐射的敏感性也不同，一般来说，M期细胞的耐受性最低,G2期细胞次之。放射引起DNA损伤后导致其在细胞周期监测点机制的纺锤体检查点和DNA结构检查点无法通过，从而滞留在M期[9]。研究结果显示，细胞在G2/M期的阻滞随着照射剂量增大而延长，表明细胞损伤修复的难易程度随剂量增加而提高。而低剂量照射后，细胞越过阻滞后出现第二次较低峰值，可能是因为G2/M期阻滞形成类似于同步化功能，大量细胞共同进入同一时相所致。细胞增殖实验结合流式细胞术检测细胞周期与凋亡实验推断，放射并不直接杀死所有细胞，而是造成DNA损伤后，大部分细胞经过数次分裂增殖或长时间细胞周期阻滞而诱发凋亡。

DNA双链断裂损伤是放射作用于细胞基因组的严重损伤，双链断裂得不到修复会直接诱导细胞凋亡和坏死。中性单细胞凝胶电泳是一种能够比较直观检测DNA双链损伤的实验手段，通过对单细胞形成的彗星形态的DNA片段量化分析判断其DNA损伤程度[10]，从而更直观地验证DNA双链的损伤。

H2AX是组蛋白的一种，存在于所有真核细胞，与其他组蛋白共同作用结合染色质形成核小体。其羧基端的139位为丝氨酸残基组成的丝氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸结构域，该丝氨酸残基在DNA双链断裂损伤发生时可迅速被磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinase，PI3K)、关卡基因蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)、Rad-3相关蛋白(Rad-3 related protein,ATR)、DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)复合体等多种DNA修复相关蛋白磷酸化成γH2AX，γH2AX在DNA双链断裂损伤位点形成焦点复合物，并进一步募集下游相关修复蛋白进行DNA修复[11]。DNA-PK复合物包括DNA PKcs和Ku70/Ku80亚基，属于丝氨酸/苏氨酸激酶[12]，是DNA双链损伤的非同源链接修复的重要分子，在修复过程中募集其他修复蛋白共同参与[13,14]。并且DNA-PKcs在DNA损伤相关的H2AX磷酸化反应中发挥着主导作用[15]。本研究结果显示，γH2AX在照射后迅速形成焦点，随着损伤的修复逐渐降低，但在8 h前后再次出现一个较低的峰值，可能与大部分细胞修复完成后从G2/M期阻滞中解放出来后有关。

综上，血管内皮细胞损伤是放射性心脏病的重要发病机制，本研究证实在γ射线照射的情况下，血管内皮细胞存活率降低，G2/M期阻滞明显，DNA双链损伤加重，同时DNA损伤修复相关蛋白γH2AX 和DNA-PKcs表达增加。DNA损伤在机体放射损伤中起着至关重要的作用，该研究首次探讨了DNA损伤修复相关蛋白γH2AX 和 DNA-PKcs在血管内皮细胞放射损伤中的表达变化，上述蛋白分子能否在放射性心脏病的防治中发挥作用，仍有待于进一步研究。

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