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虫草菌粉对急性百草枯中毒大鼠肺损伤的治疗及相关机制

2016-04-19张诗昊丁青青

中国民族民间医药·上半月 2016年3期

张诗昊 丁青青

【摘 要】 目的:观察虫草菌粉对急性百草枯中毒大鼠肺损伤的治疗作用及相关机制。方法:选用健康成年SD大鼠112只(雌雄各半),随机分为A、B、C、D组。A组(健康对照组)7只,B组(单纯染毒组)35只,C组(虫草菌粉治疗组)35只,D组(虫草菌粉对照组)35只。B、C组给予一次PQ 20mg/Kg腹腔注射,A、D组给予一次等量生理盐水腹腔注射。C、D组每日给予虫草菌粉5g/kg灌胃。观察4组大鼠状况、病理学变化与相关指标水平变化。结果:A、C、D组大鼠各时间点精神状态、活动度均表现良好,呼吸平稳;C组与A、D组比较。大鼠状况与病理学变化明显,各指标水平差异均有统计学意义(P<0.05);经虫草菌粉灌胃,C组与B组比较症状明显改善;且C组大鼠肺组织损伤程度、血清中MDA、SOD、GSH-Px水平,C组肺湿/干重比值(W/D)、肺损伤肺组织中α1-AT水平均显著优于B组(P<0.05)。结论:虫草菌粉对PQ中毒引起的急性肺损伤有较好的治疗作用,可清除氧自由基,提高机体抗氧化损伤、抑制脂质过氧化,可促进α1-AT表达,减轻PQ中毒引起的肺组织损伤。

【关键词】 百草枯中毒;虫草菌粉;肺损伤

【中图分类号】R595.4 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2016)05-0081-03

百草枯(PQ)有着良好的除草效果,且使用范围广泛,但中毒死亡率极高,对医疗工作者提出了巨大的挑战。PQ中毒致死量小,肺组织中毒物浓度最高,因此肺损伤最为严重,患者多死于呼吸窘迫综合征,死亡率可高达85%~95%[1]。目前治疗百草枯中毒的中成药还比较少。虫草菌粉是从新鲜冬虫夏草中分离得到菌丝体,经发酵培养所得菌丝体的干燥粉末,开展虫草菌粉对急性百草枯中毒大鼠肺损伤研究可为开拓临床应用范围和指导临床实践、增加适应症,提供实验依据和理论基础[2]。实验通过复制PQ急性中毒大鼠模型,观察虫草菌粉对PQ中毒所致急性肺损伤的治疗作用及机制,以便采取中西医结合以及其他综合治疗措施,延长患者寿命。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 健康成年SD大鼠112只(雌雄各半),体质量250~300g,由赣南医学院实验动物中心提供。20%百枯草原液(先正达(中国)投资有限公司);虫草菌粉(批号:040801,江西金水宝制药有限公司)。MDA试剂盒(批号:20101022)、SOD试剂盒(批号:20101025),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号:20101025)均购自南京建成生物工程研究所。α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)蛋白抗体、免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 分组及给药 选用健康成年SD大鼠112只,随机分为A、B、C、D组。A组:健康对照组7只;B组:单纯染毒组35只;C组:虫草菌粉治疗组35只;D组:虫草菌粉对照组35只。B、C组给予一次PQ20mg/Kg腹腔注射,A、D组给予一次等量生理盐水腹腔注射。C、D组每日给予虫草菌粉5g/kg灌胃,A、B组每日给予等量生理盐水灌胃。

1.3 标本采集与检测 B组、C组分别于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取5只大鼠心脏取血处死,留取血标本,测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。A组、D组也在相同时间点测定以上指标,测定方法按试剂盒说明进行。同时,以上各组均取大鼠整个左肺,用滤纸吸干血渍,分析天平称重后放入80℃恒温烤箱烘烤24h,计算肺湿/干重比值(W/D),右肺前叶组织制备病理切片,进行苏木精-伊红染色(HE),在400倍光镜下进行病理观察。应用免疫组化法,PQ中毒急性肺损伤肺组织中α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)的表达(肺组织石蜡切片免疫组织化学方法检测α1-AT蛋白表达,按试剂盒说明书操作)。采样方法:心脏取血处死大鼠,采血收集血样并取出左、右肺,采血注射器及试管均在实验前用500u/ml肝素湿润。α1-AT免疫组化染色阳性切片与40HP物镜下挑选10个视野观测阳性细胞胞浆平均吸光度(OD),以其单位面积相对含量反应染色强度。

1.4 统计分析 采用SPSS17.0统计软件进行数据的处理分析,计量资料均采用均数加减标准差(x±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析,组内比较采用LSD最小显著差法,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况 A组与D组大鼠精神状态良好,活动如常,能够自由进食饮水。B组大鼠在腹腔注射PQ 2h开始出现精神差,萎靡不振,伴有不同程度的毛发松散、眯眼、步态蹒跚与拱背。1d后出现四肢末端、口唇紫绀,呼吸加快加深,并随着时间的延长而加重;3~7d后出现触之反应差,静伏,呼吸急促或点头样呼吸,甚至呼吸窘迫情况,全身出现明显紫绀;14d后存活的大鼠症状开始逐渐减轻,并恢复正常;21d后存活大鼠再次出现呼吸频率加快、气促,个别大鼠死亡前出现呼吸困难、紫绀等缺氧症状,其余无明显紫绀。C组与B组比较,大鼠各时间点精神状态、活动度均表现良好,呼吸平稳,症状明显改善。

2.2 大鼠肺组织病理学变化 A组与D组大鼠肺组织结构完整,肺脏表面呈粉红色,质软富有弹性,表面光滑。B组大鼠1d肺泡结构清晰,肺泡腔可见少量炎性细胞渗出,表面仅见散在点状出血;3d肺泡结构可辨认,肺泡壁局部增厚,肺泡腔大量炎性细胞渗出;7d肺组织中表现出巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润,部分肺泡腔有透明膜形成,充满水肿液,肺泡壁断裂,严重的有弥漫性肺出血,甚至结构消失,随着时间的延长,肺组织损伤程度逐渐加重;14d出现部分肺泡间隔纤维性增厚,肺泡结构不清,肺泡腔内充满炎性细胞渗出,但较之前减少,可见胶原纤维增生;21d大部分肺泡明显塌陷,形成纤维细胞进一步增多;28d肺明显形成纤维化,肺泡腔、肺间质内炎性细胞浸润,且生成大量纤维细胞;35d大鼠肺纤维化病灶数明显增多。虫草菌粉干预的C组大鼠肺组织损伤比B组显著更轻。

2.3 血清中MDA、SOD、GSH-Px测定比较 各时间点四组大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px水平见表1-3。

2.4 大鼠肺湿/干重比值(W/D)、肺损伤肺组织中α1-AT水平 A组W/D值:(2.44±0.16),B组W/D值:(5.05±1.31),C组W/D值:(3.87±1.00),D组W/D值:(2.68±0.13)。B组与C组W/D值均显著与A组与D组(P<0.01),且C组W/D值显著低于B组(P<0.01)。

2.5 四组大鼠肺损伤组织中α1-AT水平对比 对比观察四组大鼠肺损伤组织中α1-AT水平。见表4。

3 讨论

PQ是一种高效能的非选择性接触型除草剂,对人畜具有很强毒性,赣南地区百草枯在农村应用广泛,临床工作中PQ中毒患者屡见不鲜。肺是主要靶器官,PQ中毒可导致“PQ肺”,早期表现为急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS),后期出现肺泡内和肺间质纤维化,是PQ中毒致死的主要原因,其中单纯因肺部损伤死亡所占的比例达50%~70%[3]。研究发现,大鼠在腹腔注射PQ 2h开始出现精神差,萎靡不振,伴有不同程度的毛发松散、眯眼、步态蹒跚与拱背。1d后出现四肢末端、口唇紫绀,呼吸加快加深,并随着时间的延长而加重;3d后出现触之反应差,静伏,呼吸急促,甚至呼吸窘迫情况;7d与14d,表现为为急性肺损伤;21~35d大鼠急性损伤基本缓解,同时现肺纤维化。C组与B组比较,大鼠各时间点精神状态、活动度均表现良好,呼吸平稳,症状明显改善;而经组织病理观察,大鼠PQ中毒后肺组织中表现出巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润,部分肺泡腔有透明膜形成,充满水肿液,肺泡壁断裂,严重的有弥漫性肺出血,甚至结构消失,随着时间的延长,肺组织损伤程度逐渐加重。

PQ中毒所致的急性肺损伤目前无特效解毒药物,研究主要在氧自由基损伤方面展开,抗氧化剂维生素C、维生素E、色甘酸钠、还原型谷胱甘肽都曾经用于治疗PQ中毒急性肺损伤[4],但效果都不确切。研究表明[5],虫草菌粉在肺组织炎性及纤维化疾病中有一定的治疗作用。超氧化物歧化酶(SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)广泛存在于需氧物体,均为构成肺内抗脂质过氧化酶性保护系统的主要酶,是体内最重要的自由基清除剂,其活性间接反映了机体清除自由基的能力。丙二醛(MDA)是机体内氧自由基代谢过程中产生的脂质过氧化产物,反映了机体脂质过氧化自由基的存在与过氧化反应的程度[4]。PQ进入体内后,经自由基损伤作用造成肺组织氧化性损伤,因此对SOD、GSH-Px活性、MDA浓度的变化进行监测能够反映机体清除自由基、抗脂质过氧化损伤的能力[4-5]。研究结果表明,PQ中毒大鼠血清的SOD、GSH-Px活性显著下降,MDA浓度显著升高,该改变可能与PQ在体内代谢中生成活性氧自由基过程有关,在PQ进入体内后先产生氧离子,在SOD的作用下形成H2O2,中毒早期血浆中SOD活力显著下降,而中毒中晚期SOD活力稍有升高。GSH-Px活性随着时间的延长呈显著下降,可能与PQ中毒后期H2O2较多有关[6],迅速形成的大量的OH-将大量消耗GSH-Px。给予PQ中毒大鼠以虫草菌粉治疗,血清中MDA含量明显下降,而SOD活性明显升高,结果提示虫草菌粉可通过清除氧自由基,提高机体抗氧化损伤、抑制脂质过氧化,达到PQ对肺组织损伤的作用。另外,研究发现,在急性肺损伤模型中,内毒素组α1-AT 活性明显低于对照组,可能因急性肺损伤造成弹性蛋白酶、胰蛋白酶大量释放,造成蛋白酶与抑制剂比例失衡,ARDS患者注射α1-AT抑制弹性蛋白酶的活性,可减轻内毒素引起的肺组织损伤[6]。本研究结果表明,百草枯中毒大鼠血清肺组织中α1-AT水平在中毒7d后显著下降,而采用虫草菌粉可促进α1-AT表达,减轻PQ中毒引起的肺组织损伤。

综上所述,虫草菌粉在PQ急性中毒中有较好的治疗作用,治疗作用与减轻自由基损伤,促进α1-AT表达有关。

参考文献

[1]支巧明,孙海晨,钱晓明,等.依达拉奉对百草枯中毒大鼠肺损伤的保护作用[J].医学研究生学报,2010,23(10):1033-1037.

[2]吴冰,郑彦宏,侯振才,等.乌司他丁对百草枯诱导急性肺损伤的保护作用研究[J].中国老年保健医学,2015,13(2):65-67.

[3]黄丽,李莉,兰超,等.阿托伐他汀对鼠急性百草枯中毒肺损伤的保护作用[J]. 河南医学研究,2013,22(4):485-487.

[4]刘树峰,严首春.乌司他丁对大鼠百草枯中毒急性肺损伤的治疗作用[J].中国美容医学,2012,21(10):125.

[5]杨礼腾,刘欣,程德云,等.虫草菌粉调控肺纤维化大鼠肺胶原代谢失衡的作用及其机制[J].时珍国医国药,2012,23(5):1297-1299.

[6]郭兰萍,梁标,吴斌,等.丹参在兔肺气肿病理形成中对肺组织抗胰蛋白酶分泌的影响[J].广东医学,2002,23(6):571-573.

(收稿日期:2015.12.25)