回药失羂剌知丸抗大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡的实验研究

左艳丽　贾孟辉　于凌志　王佩佩　刘丽　苏丹　李占涛

【摘 要】 目的：观察回药失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中Fas及FasL表达的影响，探讨失荅剌知丸治疗脑缺血性疾病的机制。方法：SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，局灶性脑缺血再灌注模型制备成功后分别于12h、24h、72h取材，采用干湿重法测脑含水量，免疫荧光法观察Fas阳性细胞表达量，TUNEL和免疫组化法观察神经细胞凋亡情况及FasL表达的变化。结果：与假手术组相比，缺血再灌注损伤后脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达明显增高（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，用药组各时段脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达均减弱（P<0.05），以失荅剌知丸高浓度组的表达减弱显著（P<0.01）。结论：失荅剌知丸能够有效减轻脑组织水肿，抑制Fas、FasL的表达，其发挥神经保护的作用机制可能与抑制神经细胞凋亡有关。

【关键词】 失荅剌知丸；脑缺血；Fas；FasL

【中图分类号】R743 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）05-0073-04

Abstract：Objective： To observe the effect of expression of Fas and FasL in the hippocampus of ischemia-reperfusion injury rats brain tissue by taking Shida Lazhi Wan， and to explore Shida Lazhi Wan mechanism for the treatment of cerebral ischemic diseases. Methods： SD male rats were randomly divided into 6 groups： sham group，the ischemia reperfusion model group （hereinafter referred to as the model group），JinNaDuo group，Shida Lazhi Wan low concentration group， Shidalazhiwan medium concentration group，Shida Lazhi Wan high concentration group， After focal cerebral ischemia models were established，at 12h、24h、72h，neurons apoptosis，wet and dry weight measured brain water content， immunofluo-rescence techniques to measure Fas expression，TUNEL and immunohistochemical method to observe neuronal apoptosis and the change of FasL expression. Result： To compared with the sham operation group，after ischemia-reperfusion injury ， brain water、number of nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were significantly increased（P<0.01， P<0.05）；compared with the model group， every treatment groups brain water number、nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were recede （P<0.05），especially Shida Lazhi Wan high concentration group Reduce significantly （P<0.01）. Conclusion：Shida Lazhi Wan can ？reduce brain water effectively， inhibition of Fas and FasL express， its nerve protection mechanism may be related to inhibition of neural cell apoptosis.

Keywords：Shida Lazhi Wan；ischemia reperfusion；Fas；FasL

随着人口老龄化进程的加速，高血压、冠心病等相关危险因素的增加，脑血管疾病的发病率也逐年攀升，对人类的生命健康和生活质量造成了严重的威胁。其中，缺血性脑血管疾病最为常见，约占脑血管疾病的80%左右[1]。目前，临床上最常用的是在有限的时间内进行溶栓等治疗以达到恢复脑血管血液供应的目的，但有可能造成脑组织的进一步损伤，即脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤机制庞杂，相互交联，有研究表明，细胞凋亡在其发病进程中担任着至关重要的角色。细胞凋亡多发生于脑缺血急性期，主要出现在缺血半暗带区和对缺血缺氧敏感的海马、齿状回和大脑皮质[2]，神经细胞凋亡数量的多少决定着脑组织梗死体积的大小。细胞凋亡是一个有严格程序控制的可逆过程，因此，着力于调控其机制，限制其进一步发展，对减小脑梗死体积以及神经功能恢复等具有重大意义[3]。失荅剌知丸作为回医药治疗脑缺血性疾病的传统、经典方药，前期系列研究业也表明：失荅剌知丸可以调节细胞抗凋亡信号转导通路PI3K-AKT通路的活性，上调PI3K和AKT的表达，通过抑制促凋亡分子的活化，抑制神经细胞凋亡[4]。Fas/FasL 是目前研究较为清楚的死亡受体信号转导通路，在正常大脑中维持免疫抑制状态，当脑缺血发生后，Fas与FasL交联，参与并促进脑缺血再灌注所引起的脑组织损伤[5]。为进一步探讨失荅剌治丸保护缺血再灌注损伤脑组织的作用机制，笔者开展失荅剌治丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织FasL表达水平的实验研究，现报告如下。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠，雄性，80只，SPF级，体重（280±50）g，购于宁夏医科大学实验动物中心，合格证编号：SCXK（宁）2011-0001，所有大鼠均在同一动物房内常规饲养3d后进行实验。

1.2 药物 失荅剌知丸（出自《回回药方考释》）：柴胡30g，黑诃子30g，芦荟60g，元胡6g，石菖蒲6g，番盐6g，药西瓜9g，松蕈9g，安息香9g，阿魏9g，砂糖15g，干姜3g，胡椒3g，荜拨3g，白芥子3g，芸香3g，巴豆9g，共计213g，以上所有药物切制、煎煮后放置于恒温水浴锅中分别浓缩至低浓度1.112 g/ml、中浓度2.223g/ml、高浓度4.446g/ml的药液，置于4 ℃冰箱备用。金纳多（银杏叶提取物，德国威玛舒培公司）临用前配制成1.04mg/ml的混悬液。

1.3 试剂 水合氯醛（批号：2636-4A，国药集团化学试剂有限公司，临用前配成浓度为10%的水合氯醛溶液）；兔抗大鼠Fas抗体（批号：BA0048）、兔抗大鼠FasL抗体（批号：BA0148）、山羊抗兔IgG（批号：BA1128）、浓缩型正常山羊血清（批号：AR1009）均为博士德生物公司产品。

1.4 仪器 FX4-2型电热恒温干燥箱（Shella公司）：BT224S 型电子天平（Sartorious公司）。

2 方法

2.1 分组及给药 80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，后5组采用线栓法制备大脑中动脉阻塞-再灌注模型，并分为术后12、24、72h三个亚组，共16组，每组5只。SD大鼠给药量为1ml/100g，用药组分别给予相应药物，于造模前30min第一次灌胃，以后每天2次，直至取材；假手术组、模型组给予相应浓度的生理盐水。

2.2 模型制备 参照改良的Longa法[6]，利用线栓阻塞大鼠大脑中动脉，造成脑缺血2h后再灌注模型。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位，沿颈部正中线切开，依次钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将直径为0.24mm的线栓自颈外动脉小切口处插入至颈内动脉，直至感到轻微阻力，长度约为18±2mm，用手术缝合线将颈外动脉小切口和线栓尾端一起结扎，阻断血流2h后实行再灌注，待大鼠清醒后进行神经功能评分，评分≥2分者作为模型成功标准。假手术组钝性剥离颈内外动脉后缝合伤口。

2.3 取材 各组分别于术后12h 、24h、72h取材，10%水合氯醛过量麻醉大鼠，经心尖生理盐水冲洗，再换用4%多聚甲醛溶液进行灌注固定，取出全脑，切取缺血侧大脑海马区，常规石蜡包埋，余脑组织放于冻存管保存在液氮内。

2.4 脑含水量测定 采用干湿质量法测定缺血侧含水量，于各时间点麻醉大鼠，快速断头取脑，将待测脑组织滤纸擦去表面水分，称取湿质量后置于100℃电烤箱24h，称取干质量。脑含水量 =（m湿质量-m干质量）/m湿质量×100%。

2.5 脑组织病理学观察 待测脑组织切片后经HE染色，在光学显微镜下观察脑组织结构的变化。

2.6 TUNEL细胞凋亡检测 标本经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，严格按TUNEL检测试剂盒进行操作。以胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞，在400倍镜下随机选取梗死灶周边五个不重叠的视野拍照并计数凋亡阳性细胞数，取平均数进行统计。

2.7 免疫荧光法检测Fas表达 待测脑组织经过常规包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复、复温、山羊血清封闭、滴加兔抗大鼠抗体、滴加山羊抗兔荧光二抗、封片、荧光显微镜下观察，假手术组对照使用PBS缓冲液代替一抗，余相同，所有步骤严格按照试剂盒说明操作。每个标本取 3 张切片，每张切片取3 个互不重叠部位，应用激光扫描共聚焦显微镜扫描（扫描参数：激发光波长488 nm，检测的发射光波长518nm），计数400×视野下荧光阳性细胞，取平均值。

2.8 免疫组化法检测FasL表达 标本切片为6mm，经常规二甲苯和梯度酒精脱蜡水化，枸橼酸钠缓冲液抗原修复，3% H2O2消除内源性过氧化物酶，滴加10%的山羊血清封闭1h，滴加一抗4℃冰箱过夜，阴性对照组加PBS缓冲液，次日取出37℃复温1h，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，滴加二抗室温置放1h，DAB染色，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，中性树胶封片，显微镜下观察。以胞质或胞核内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每张切片在400倍镜下随机选取梗死灶周边5个不重叠的视野拍照，并计数阳性细胞数，取平均数进行统计。

2.9 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，以均数加减标准差（x±s）表示，使用单因素方差分析法，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 脑含水量测定 与假手术组相比，各组各时间点脑含水量均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点脑含水量均明显降低（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中浓度及高浓度组脑含水量有不同程度的降低（P<0.05或P<0.01）；同组别72h相比，失荅剌知丸高浓度组减少更加明显（P<0.01）。见表 1。

3.2 病理学观察 假手术组大鼠脑组织神经元形态正常，大小均匀，排列整齐，层次分明；模型组大鼠神经形元态明显异常，大小不均，神经元皱缩，排列紊乱，层次不清，多数细胞核呈现三角形或锥形；失荅剌知丸低剂量神经元细胞较紊乱，多数皱缩变形，大小欠均匀；金纳多组及失荅剌知丸中浓度组大多数神经元形态欠规则，有皱缩现象，层次欠清晰，且各时间点神经元形态区别不明显；失荅剌知丸高浓度组大鼠大多数神经元形态正常，存有少量皱缩神经元，层次较清晰，且正常神经元比例随着用药时间的延长而增多，以失荅剌知丸组72h组较明显。

3.3 各组缺血侧海马区Fas表达比较 Fas蛋白主要位于神经细胞膜上，在本实验中标记为绿色，与假手术组相比，各组各时间点Fas表达均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点Fas蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点Fas蛋白表达有所减少（P<0.05），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表2。

3.4 对大鼠脑缺血再灌注TUNEL凋亡阳性细胞的影响 从表3看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点凋亡细胞数有显著增高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组各时间点凋亡细胞数有减少（P<0.05或P<0.01），以24h、72h凋亡细胞数减少尤为明显（P<0.01）；失荅剌知丸组24h、72h组凋亡细胞数明显少于金纳多组（P<0.01）。见表3。

3.5 对脑缺血再灌注大鼠缺血侧海马区FasL表达的影响 从表4可以看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点FasL蛋白表达明显增高（P<0.01）；与模型组比较，各用药组各时间点FasL蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达无显著性差异（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点FasL蛋白表达有所减少（P<0.05或P<0.01），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表4。

4 讨论

近年来，国内外研究发现脑缺血再灌注损伤主要与兴奋性氨基酸、自由基损伤、血脑屏障破坏、炎症反应、细胞凋亡等机制有关[7-8]。这些机制彼此重叠，互为因果，相互联系，产生一系列快速级联反应，最终导致脑组织的损伤[9]。在这个复杂的过程中，神经细胞的凋亡被认为是脑缺血再灌注损伤的主要环节，因此调控神经细胞凋亡成为治疗缺血性脑病的关键所在。FasL在细胞凋亡中起着关键的作用。Fas被称为死亡受体分子，属于肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）/神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）受体家族，是促细胞凋亡的最重要分子之一。FasL作为Fas的天然配体与3个Fas 分子结合，促使死亡结 构域（DD）聚集后结Fas 的相关死亡结构域（FADD），进而通过引起Caspase 酶联反应致使细胞凋亡[10]。抑制因促凋亡系统Fas/FasL的激活而产生的生物学作用是发挥保护脑组织的关键环节[11]。已有大量研究发现中医药可以减轻脑缺血再灌注损伤后促凋亡因子的表达[12-13]。

失荅剌知丸出自《回回药方》，是防治脑血管疾病的经典方剂，由柴胡、黑诃子、芦荟、元胡、石菖蒲、药西瓜、阿魏、 安息香、干姜、胡椒、荜拨、白芥子、芸香等药组成，以芳香通窍，利痰化湿，祛寒通络为治疗原则，运用大量芳香药以加强血管通透性、增强药物透过血脑屏障[14]，治疗脑卒中后骨节疼痛，口眼歪斜，半身不遂等症状。研究结果显示，脑缺血再灌注损伤发生后，对缺血缺氧敏感的海马区脑含水量及神经细胞凋亡的数量迅速增加，于24h达到高峰，72h后下降。较模型组比较，各用药组脑含水量及神经细胞凋亡的数量均有所减少，但不同浓度的失荅剌知丸下调水平有所差别，以失荅剌知丸高剂量组效果明显，说明长期服用高浓度的失荅剌知丸可以通过抗凋亡以达到有效治疗和缓解脑缺血再灌注损伤后引起的脑组织损伤。Fas、FasL在脑组织缺血后，迅速表达促进了神经细胞凋亡，扩大了梗死体积，实验研究结果表明，不同浓度的失荅剌知丸较模型组相比，能够明显下调海马区Fas、FasL蛋白表达，较金纳多组相比，高剂量失荅剌知丸阻抑Fas、FasL蛋白表达作用更强。由此可见，失荅剌知丸可以通过降低Fas、FasL蛋白表达以减少神经细胞的凋亡，为临床回医药防治缺血性脑血管疾病提供了实验依据。

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（收稿日期：2015.12.22）