水飞蓟宾对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠保护作用的研究

张秀侠

(武安市第一人民医院神经内科，河北 邯郸　056300)



水飞蓟宾对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠保护作用的研究

张秀侠

(武安市第一人民医院神经内科，河北 邯郸056300)

摘要：目的研究水飞蓟宾(SIL)对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法取112只清洁级雄性大鼠随机分为6组：假手术组、模型对照组、水飞蓟宾(100、200和400 mg·kg(-1))预处理组和尼莫地平(32 mg·kg(-1))预处理组，通过中动脉线栓法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型。再灌注6 h后，进行神经功能评分，分析测定脑组织梗死体积及含水量；通过苏木精-尹红(HE)染色法观察脑组织形态学变化；测定血清中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量及总抗氧化能力(T-AOC)水平；测定脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量；通过TUNEL染色观察神经细胞凋亡状况并计算凋亡指数(AI)，通过Western blot方法测定脑组织中NF-κB蛋白表达并进行半定量分析。结果与模型组相比，水飞蓟宾(200和400 mg·kg(-1))预处理组大鼠神经功能评分显著降低、脑梗死体积和含水量均显著降低，脑组织病理形态学变化及神经细胞凋亡均明显减轻，凋亡指数显著降低；脑组织中SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低；血清中CPK，LDH含量显著降低；脑组织中NF-κB蛋白表达量显著降低；水分蓟宾400 mg·kg(-1)预处理组血清中T-AOC水平显著升高；差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结论水分蓟宾对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用，其作用机制可能与水分蓟宾能够改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中抗氧化酶活性、抑制氧化应激损伤有关。

关键词：水分蓟宾；脑缺血再灌注；大鼠；保护

水飞蓟宾(Silibinin，SIL)是菊科植物水飞蓟的主要活性成分之一，属于水飞蓟素的一种，具有抗氧化、抗肿瘤、抑制炎症反应、抗纤维化、促进细胞再生和促进脂代谢等广泛的药理学作用[1-4]。王利平等[5]研究发现水分蓟宾对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，本研究通过中动脉线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型，研究水分蓟宾对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。

1材料与方法

1.1试验药物与试剂水飞蓟宾胶囊(天津天士力制药股份有限公司，药品规格：每粒35 mg，批号：20140517)；尼莫地平片(德国拜耳公司，批号：BJ05004，规格：每片30 mg)；磷酸肌酸激酶(CPK)、乳鼠脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒；苏木精—尹红(HE)染色试剂盒、末端标记法(TUNEL)检测试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司；核转录因子-kB(NF-κB)单克隆抗体购自南京建成生物工程研究所。

1.2实验动物SPF级雄性SD大鼠，240～280 g，购自河北省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003，室温23～25℃、相对湿度60%～70%、光照周期12 h:12 h环境中饲养。

1.3主要仪器BS300型全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；UV-1200 紫外-可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；24D台式高速离心机(深圳市赛泰克生物科技有限公司)；FA25匀浆机(上海洽姆仪器科技有限公司)；DYY-11 型多用电泳仪(北京六一仪器厂)；JY-SCZ2电泳槽(北京六一仪器厂)；RM-2135型切片机(德国Leica公司)；倒置光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.4方法

1.4.1动物分组及模型制备取112只实验用清洁级雄性SD大鼠随机分为：假手术组、模型对照组、水飞蓟宾(100、200和400 mg·kg-1)预处理组和尼莫地平(32 mg·kg-1)预处理组；水分蓟宾各预处理组和尼莫地平预处理组均于手术前7 d开始灌胃给药，每天1次，假手术组和模型对照组分别给予等体积的生理盐水。除假手术组外，其余各组大鼠经腹腔注射水合氯醛实施麻醉后，参照Longa等[6]报道的试验方法制备局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型；假手术组行手术通路，除不插入栓线外，其余操作同手术组。

1.4.2神经功能评分再灌注6 h后，行盲法评分：置地上，向缺血对侧转圈，计1分；提鼠尾，对侧前肢出现腕屈曲、肘屈曲、肩内旋，分别计1、2、3分；对侧推动时阻力下降，据下降程度计1～3分；置金属网上，据对侧肌张力下降程度计1～3分。

1.4.3梗死体积(IV%)的测定再灌注6 h后，断头取脑，去除嗅球、小脑和脑干后沿冠状做5个切片，置于1% TTC染色液中，于37℃水浴环境中避光孵育30 min后，正常脑组织呈红色，梗死区呈苍白色；用图像分析软件Imagepro Plus 6.0分析梗死体积百分比。

1.4.4含水量的测定再灌注6 h后，参照“1.4.3”的方法取大脑组织，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干后称重，为湿重；置于110℃恒温干燥箱中烘烤48 h后称重，为干重，然后计算脑组织含水量：

脑含水量=[(湿重-干重)/湿重]×100%

1.4.5脑组织形态学改变的观察再灌注6 h后，参照“1.4.3”的方法取大脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，经石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)和展片处理后，行常规HE染色，然后在光学显微镜下观察脑组织形态学变化。

1.4.6脑组织中SOD、CAT活性和MDA含量的检测再灌注6 h后，参照“1.4.3”的方法取大脑组织，于冰上剪碎后加入适量冷裂解液后进行研磨匀浆，3 000 rpm离心10 min后取上清液，通过紫外—可见分光光度计测定脑组织中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.4.7血清中CPK、LDH含量和T-AOC水平的检测再灌注6 h后，腹腔注射10%水合氯醛实施麻醉，经腹主动脉取血，经2 000 rpm离心5 min后取血清，然后通过全自动生化检测仪测定各组大鼠血清中CPK、LDH含量及T-AOC水平。

1.4.8神经细胞凋亡的观察及凋亡指数(Apoptosis Index，AI)的计算取“1.4.5”所制备的脑组织石蜡切片，按照检测试剂盒方法步骤行TUNEL染色(黄褐色为阳性着色)，于光学显微镜下观察神经细胞凋亡状况；每张染色切片选取6个视野，计数视野内细胞总数和凋亡细胞数，取平均值，然后计算各组大鼠神经细胞AI：

AI=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%

1.4.9NF-κB蛋白表达的检测及半定量分析取“1.4.6”制备的脑组织匀浆上清液，，BCA法进行蛋白定量，变性后上样、电泳：待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜、春红溶液染色，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4℃过夜；洗膜，二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色，实验结果应用Quantity One软件进行分析。

2结果

2.1各组大鼠神经症状评分的变化较假手术组，模型组大鼠神经症状评分显著升高；经水分蓟宾(200、400 mg·kg-1)预处理后，局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分显著降低，差异均具有统计学意义(P<0.01、0.05)，结果见表1。

2.2各组大鼠脑组织梗死体积和含水量的变化较假手术组，模型组大鼠脑组织梗死体积和含水量显著升高；经水分蓟宾(200、400 mg·kg-1)预处理后，局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织梗死体积和含水量均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01、0.05)，结果见表1。

±s,n=16)

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01。2.3各组大鼠脑组织结构形态学变化假手术组大鼠脑组织结构未见异常，而模型组大鼠缺血侧脑组织出现明显水肿，神经元呈空泡状，胞浆疏松、胞质染色不均，胞核固缩、深染等病理性形态学改变；经水分蓟宾预处理后，缺血区神经元形态学改变明显减轻，其中以400 mg·kg-1预处理组效果最为显著，结果见图1。

图1　各组大鼠脑组织形态学变化(HE×400)

注：A-假手术组；B-模型组；C-水分蓟宾100 mg·kg-1组；D-水分蓟宾200 mg·kg-1组；E-水分蓟宾400 mg·kg-1组；F-尼莫地平32 mg·kg-1组。

2.4各组大鼠脑组织SOD、CAT活性和MDA含量的变化较假手术组，模型组大鼠脑组织中SOD、CAT活性均显著降低且MDA含量显著升高；而经水分蓟宾(200、400 mg·kg-1)预处理后，局灶性脑缺血再灌注组大鼠脑组织SOD、CAT活性显著升高，MDA含量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01、0.05)，结果见表2。

表2各组大鼠脑组织中SOD、CAT活性

组别剂量/mg·kg-1SOD/U·mgprot-1CAT/U·mgprot-1MDA/nmol·mgprot-1假手术组—15.8±3.64.4±1.65.0±1.2模型组—7.4±2.9**2.5±1.0**7.1±1.6**水分蓟宾组1008.3±3.52.7±1.26.8±1.720010.9±3.4△3.4±1.3△5.6±1.4△△40012.7±3.7△△4.0±1.7△△5.2±1.2△△尼莫地平组329.6±3.1△2.9±1.25.5±1.5△△

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01。

2.5各组大鼠血清中CPK、LDH含量及T-AOC水平的变化较假手术组，模型组大鼠血清中CPK、LDH含量显著上升而T-AOC水平显著降低；经水分蓟宾(200、400 mg·kg-1)预处理后，局灶性脑缺血再灌注组大鼠血清中CPK和LDH含量显著降低，T-AOC水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，结果见表3。

表3各组大鼠血清中CPK、

组别剂量/mg·kg-1CPK/U·L-1LDH/U·L-1T-AOC/U·L-1假手术组—162.3±14.1179.6±18.315.9±3.4模型组—357.5±32.8**365.7±31.5**7.6±2.5**水分蓟宾组100316.7±30.2320.3±29.68.3±2.9200264.8±27.5△281.4±26.8△9.8±3.1△400225.6±24.7△△253.2±22.9△△12.1±3.5△△尼莫地平组32270.1±26.3△276.5±27.1△9.2±2.8

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01。

2.6各组大鼠神经元凋亡状况及凋亡指数(AI)假手术大鼠脑组织仅存在极少量的凋亡神经元，模型组大鼠神经元凋亡状况明显加重，而水分蓟宾预处理组大鼠神经元凋亡状况较模型组明显较轻，其中以400 mg·kg-1预处理组效果最为显著，结果见图2。比较各组大鼠神经元凋亡指数发现，模型组大鼠神经元凋亡指数较假手术组显著升高；而水分蓟宾(200、400 mg·kg-1)预处理组大鼠神经元凋亡指数显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01、0.05)，结果见表4。

2.7各组大鼠脑组织NF-κB蛋白表达的变化通过Western blot检测并进行半定量分析发现：模型对照组NF-κB蛋白表达量较假手术组显著增高(P<0.01)；经水分蓟宾(200、400 mg·kg-1)预处理后，局灶性脑缺血再灌注组大鼠脑组织中NF-κB蛋白表达量显著降低(P<0.05，P<0.01)，结果见图3和表5。

图2　各组大鼠神经元凋亡状况(TUNEL×400)

注：A-假手术组；B-模型组；C-水分蓟宾100 mg·kg-1组；D-水分蓟宾200 mg·kg-1组；E-水分蓟宾400 mg·kg-1组；F-尼莫地平32 mg·kg-1组。

组别剂量/mg·kg-1AI/%假手术组—2.8±1.0模型组—40.5±5.2**水分蓟宾组10034.2±4.920026.3±4.1△40017.8±3.5△△尼莫地平组3227.1±3.9△△

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01。

图3　各组大鼠脑组织中NF-κB蛋白表达

注：A-假手术组；B-模型组；C-水分蓟宾100 mg·kg-1组；D-水分蓟宾200 mg·kg-1组；E-水分蓟宾400 mg·kg-1组；F-尼莫地平32 mg·kg-1组。

组别剂量/mg·kg-1NF-κB/β-actin假手术组—0.15±0.04模型组—0.43±0.12**水分蓟宾组1000.39±0.132000.33±0.08△4000.26±0.07△△尼莫地平组320.29±0.09△

注：与假手术组比较：**P<0.01；与模型组比较：△P<0.05,△△P<0.01。

3讨论

随着饮食结构及生活习惯的改变，尤其是人口老龄化的加剧，缺血性脑血管病的发病率有逐年上升，严重危害着人类的生命健康，目前临床上主要采用及时溶栓恢复血流再灌注的治疗方法，但往往引起脑组织损伤加重的现象，即“再灌注损伤”[8]，其病理生理机制尚未完全清楚。研究发现[9-10]，血流再灌注后抗氧化酶活性受到抑制、氧自由基大量生成与过剩，导致机体广泛的氧化应激损伤，是脑缺血再灌注损伤重要的病理基础。

水飞蓟宾(Silibinin，SIL)是菊科植物水飞蓟的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤、抑制炎症反应、抗纤维化、促进细胞再生和促进脂代谢等药理学作用[1-4]。本实验通过中动脉线栓法复制局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型进行研究，发现经水分蓟宾预处理后，能够显著改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能障碍，降低脑组织含水量，改善脑组织病变，抑制神经元凋亡，缩小梗死灶，提示水分蓟宾对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用。

综上所述，水分蓟宾对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠具有保护作用，其作用机制可能与水分蓟宾能够有效改善抗氧化酶活性、提高机体清除自由基能力、抑制氧化应激损伤有关。

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Protective effects of Silibinin on the rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury

ZHANG Xiu-xia

(DepartmentofNeurology,Wu’anFirstPeople’sHospital,Handan,Hebei056300,China)

Abstract:Objective To investigate the protective effects of Silibinin (SIL) on the rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods 112 rats were randomized into 6 groups:sham operation group,model control group,SIL 100,200 and 400 mg·kg(-1) treatment groups and Nimodipine (32 mg·kg(-1)) treatment group; focal cerebral ischemia-reperfusion rat models were made by Zea-Longa occluding suture. 6h after reperfusion,the neurological deficits,ratio of infarct volume,water content of the brain were evaluated; the histopathological changes and neurocyte apoptosis were observed,and the AI was determined. The content of CPK,LDH and the level of T-AOC in serum were determined; the activity of SOD,CAT and the content of MDA in brain tissue were determined; the expression of NF-κB protein was detected by Western blot and semi-quantitative analysis.Results Compared with model control group,the neurological scores of SIL (200 and 400 mg·kg(-1)) pre-treatment groups were significantly decreased,and the ratio of infarct volume and brain water were significantly decreased; the histopathological changes and neurocyte apoptosis of SI pre-treatment groups were significantly improved and the AI was significantly decreased; the activity of SOD,CAT in brain tissue were significantly increased and the content of MDA were significantly decreased,the content of CPK,LDH in serum were significantly decreased,the expression of NF-κB protein was significantly down-regulated(P<0.05,P<0.01),and the level of T-AOC in SIL 400 mg·kg(-1) pre-treatment group was significantly increased.Conclusions SIL had protective effects on the rats with focal cerebral ischemic-reperfusion injury,which was perhaps related with its pharmacological effects of enhancing the activity of antioxidant enzymes and depressing the oxidative stress injury.

Key words:silibinin;ischemic-reperfusion;rat;protection

(收稿日期：2015-11-05，修回日期：2015-12-24)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.010

基金项目：河北省卫生厅重点科技研究计划(No 20130359)