不同形态中国对虾贮藏过程中产生生物胺变化的分析

胡礼渊，孙高英，廖和菁（广西东兴出入境检验检疫局，广西东兴538100）



不同形态中国对虾贮藏过程中产生生物胺变化的分析

胡礼渊，孙高英，廖和菁
（广西东兴出入境检验检疫局，广西东兴538100）

摘要：为提高进出口对虾风险监控水平，利用反相高效液相色谱法测定不同形态中国对虾贮藏过程中产生生物胺的变化，结合感官检验、pH和菌落总数检测结果，分析对虾腐败进程及其原因。结果表明，在0℃和4℃下贮藏，腐胺和尸胺变化最显著，贮藏第10天质量分数分别为（206.48±14.19）mg/kg，（162.45±18.13）mg/kg和（397.48±14.19）mg/kg，（201.95±15.84）mg/kg；25℃下贮藏产生的主要生物胺是酪胺，贮藏10天质量分数达（675.66±20.25）mg/kg，其次是腐胺和尸胺。确定不同形态的对虾在0、4、25℃下贮藏，整虾的可接受期为5、4、1 d，虾仁可接受期为7、5、1 d，细菌是造成虾体内生物胺累积的主要原因。

关键词：中国对虾；生物胺；腐败；细菌；贮藏

生物胺是具有生物活性的一类低分子量有机含氮化合物，广泛存在于各类食品，尤其是高蛋白食品中。生物胺在机体内的主要形成途径是游离态氨基酸的脱羧反应，也有部分生物胺是醛和酮氨化或转氨作用而形成的，按其组成成分可分为单胺（组胺、酪胺、苯乙胺、章鱼胺）、二胺（腐胺、尸胺）和多胺（精胺、亚精胺）[1]。对人体健康危害最大的组胺和酪胺；腐胺和尸胺通过竞争机体中的解毒酶，从而增加组胺和酪胺的毒性，并且能够与亚硝基盐反应生成亚硝基吡咯烷、亚硝基哌啶等致癌物质；精胺和亚精胺能促进DNA、RNA和蛋白质的合成，加速机体生长发育，是细胞增殖的重要物质；章鱼胺是一种重要的神经介质，有调节代谢和能量平衡的功效；苯乙胺有神经调节物质、神经递质与示踪胺的作用[2]。生物胺是生物体内的正常生理组分，具有非常重要的生理功能，是合成荷尔蒙、核酸、蛋白质的前体，但当人体摄入过量的生物胺时，会引起头痛、恶心、心悸、血压变化呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命[3]。在贮藏过程中，细菌产生的消化酶以及对虾自身的自溶酶把蛋白质分解成氨基酸，经携带脱羧酶的微生物脱羧而形成生物胺，其产生的前体条件是：1）机体中含有游离的氨基酸；2）满足脱羧反应的条件；3）适宜微生物生长的环境。有研究发现，假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacteria）、发光杆菌属（Photobacterium）、弧菌属（Vibrio）是对虾肠道中发现最多的生物胺产生菌[4-8]。

中国对虾是我国养殖产量最高的三大名虾之一，具有个体大、肉质紧实，颜色鲜美等特点，并含有多种维生素及人体必须的微量元素，是高蛋白营养水产品。近年来，仅靠国内养殖的产量已跟不上消费需求，从东南亚国家进口的中国对虾数量有逐年增长的趋势，研究不同形态中国对虾贮藏过程中产生生物胺的变化，可以为水产品风险监控检测，运输贮藏保鲜技术等提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

实验用中国对虾依据SC/T 3016-2004《水产品抽样方法》[9]抽检于同一报检批越南进口冰鲜对虾，符合GB 18406.4-2001《农产品安全质量无公害水产品安全要求》[10]的鲜度和感官要求，抽样量为1000g，规格为30尾/ 1000g，装入聚乙烯抽样袋，上覆碎冰，封口运至实验室，2h内制样。取15尾对虾去头、去壳、去消化腺和鳃丝，仅留可食部分肌肉，制成虾仁，与另外15尾整虾各平均分为3组，分别置于0、4℃冰箱和25℃恒温箱中贮藏。

1.1.2试剂

苯乙胺（Phe）、组胺（His）、腐胺（Put）、酪胺（Tyr）（纯度皆为98%），尸胺（Cad）、亚精胺（Spe）（纯度为99%），章鱼胺（Oct）（纯度95 %），丹磺酰氯（纯度98 %）：均购自美国Sigma公司；乙腈、丙酮、甲醇均为色谱纯：德国CNW公司；其他试剂（皆为分析纯）：广东西陇化工有限公司；试验用水为超纯水：美国Millipore公司。

1.1.3仪器和设备

AgiLent 1200高效液相色谱仪（四元梯度泵）配紫外检测器，3-30K台式高速冷冻离心机：美国Sigma公司；SJ-Ⅱ均质器：上海昆虫科技开发公司；pHS-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；CHP9270恒温箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；CPA224S十万分之一电子天平。

1.1.4色谱条件

色谱柱：AgiLent SB C18反相色谱柱，250 mm× 4.6 mm；柱温：35℃；流动相：A：0.01 mol/L乙酸铵，B：水+乙腈（10+90）含0.01 mol/L乙酸铵；流速1 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。流动相梯度洗脱条件见表1。

表1梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

1.2方法

1.2.1感官评价

以气味、色泽、肌肉弹性为感官评价指标，将对虾的质量分为3个等级：1.可接受级（无异味、色泽光鲜、肌肉紧实），2.初期腐败级（有轻微腐败气味、色泽微红、肉质半透明），3.腐败级（异味明显、色泽暗淡、肉质软化），对整虾和虾仁进行评价。

1.2.2 pH测定

取可食部分肌肉，用剪刀剪碎，混匀。称取5.0 g放入离心管中，平行称3份，加入45 mL超纯水，搅拌均匀，放置30 min进行浸出，并不断振摇，然后过滤，滤液用酸度计测定，直接读出pH。

1.2.3菌落总数测定

参照GB/T 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[11]操作。

1.2.4生物胺测定

称取2.00g样品，置于50mL离心管中，加入10mL 0.4mol/L高氯酸溶液，均质1min，4000r/min离心5min，上清液移入25mL容量瓶中，沉淀物用10 mL 0.4 moL/L高氯酸溶液重复提取1次，合并上清液，用0.4moL/L高氯酸定容至刻度。取1.0 mL提取液加入5 mL容量瓶中，依次加入0.1 mL 2 moL/L氢氧化钠溶液、0.3 mL饱和碳酸氢钠溶液和2 mL 10 mg/mL丹酰氯溶液，盖塞，于40℃避光反应45 min，然后加入0.1 mL 25 %～28 %氢氧化铵，静置30 min，用乙腈定容到刻度，取1 mL过0.45 μm滤膜后进样，紫外检测器检测，外标法定量。

1.2.5统计分析

使用SPSS V16.0软件，对不同贮藏条件下，中国对虾的pH、菌落总数、生物胺含量进行统计分析比较，EXCEL2007绘图。

2　结果与分析

2.1品质指标的变化

中国对虾在不同贮藏条件下感官等级和pH的变化见表2。

表2不同贮藏条件下中国对虾感官等级、pH的变化Table 2 Changes in pH and sensory rating of Chinese shrimp during different storage condition

由表2可知，在10 d的贮藏时间里，对虾品质逐渐下降，至第8天，所有试验组都出现不同程度的腐败，不适宜食用，说明贮藏温度越高，腐败速度越快。0、4、25℃贮藏条件下，中国对虾感官可接受时间分别为6 d～8 d、4 d～6 d、0.5 d～1 d。虾仁和整虾相比较，相同温度下，虾仁感官可接受期比整虾滞后1 d～2 d，贮藏温度越低差异越显著。在整个贮藏过程中pH从接近中性的（7.06±0.02）升至腐败后的大于8，总体趋势是上升的。0、4、25℃贮藏条件下，温度越高，pH升高速率越大，相互间差异显著（P<0.05），整虾pH升速大于虾仁pH的升速。值得注意的是，感官等级出现变化时，pH上升的速率最大，当对虾品质达到腐败级后，pH上升缓慢，说明而虾体中的蛋白质、氨基酸及其他含氮物质被分解为吲哚、氨、三甲胺等呈碱性的产物不断增加，pH持续上升，随着机体中分解出的小分子化合物增多，能被微生物利用的小分子化合物越多，细菌增殖的速度就越快，对虾品质下降明显。

2.2菌落总数的变化

不同形态的中国对虾储藏于0、4、25℃时活菌数的变化见图1和图2。

图1中国对虾（整虾）储藏于0、4、25℃时活菌数的变化Fig.1 Chinese shrimp（whole shrimp）stored at 0，4，25℃，changes in the number of viable cells

图2中国对虾（虾仁）贮藏于0、4、25℃时活菌数的变化Fig.2 Chinese shrimp（Peeled prawns）stored at 0，4，25℃，changes in the number of viable cells

有研究表明，对虾细菌总数（个/g）≤105为一级鲜度；≤5×105为二级鲜度；细菌总数达到106～107时，对虾已严重腐败，不能食用[12]。由图1图2中得知，对虾初始细菌总数的对数值为4.12，在整个贮藏期内呈上升趋势。0℃下整虾冰藏5 d，细菌总数达过了6 lg（cfu/g），已不能食用，而经过处理的虾仁冰藏5 d仅为5.09 lg （cfu/g），至第7天为6.76 lg（cfu/g）；4℃下整虾冷藏4 d细菌总数就达到6.95 l g（cfu/g），虾仁冷藏4 d仅为5.78 lg（cfu/g），至第5天达到6.62 lg（cfu/g）；25℃下恒温贮藏仅1 d后细菌总数就超过106个/g这个腐败限值，说明25℃时中低温菌繁殖和新陈代谢加速，酶的活性增强，导致虾体内酶促和生化等一系列反应的速度加快，整虾和虾仁两者差异不显著（P>0.05）。结果表明，冰藏比冷藏对细菌生长的抑制效果更显著（P＜0.05），在0、4、25℃下贮藏，整虾可接受期为5、4、1 d，虾仁可接受期为7、5、1 d，与感官等级、pH变化趋势基本一致。

细菌是造成水产品腐败最主要的因素，虾体中细菌数量：肠道>胃>肝胰腺>鳃>甲壳>肌肉。王祥红等在野生中国对虾肠道中分离出47株菌8个属，其中优势菌属为弧菌属、发光杆菌属，次优势菌属为假单胞菌属[13]，Dempsey等对虾类的肠道菌群进行了研究，分离并鉴定了肠道菌群的好氧菌，发现弧菌属、产碱菌属、气单胞菌属、发光杆菌属和假单胞菌属占优势[14]。在对虾生长不同时期，肠道菌群的数量和组成主要受内因（肠的结构和发育阶段）和外因（摄食对象，水体环境，温度等）的影响[15]。肠炎弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌等易引起感染型食物中毒的致病菌在10℃以下不能正常发育，但有少数好气和厌气低温细菌即使在0℃也能旺盛的生长[16]。当对虾死亡后，细菌从甲壳和消化道侵入肌肉，也可以从鳃丝经血液系统侵入到肌肉内，鲜虾去头、壳、消化道后低温贮藏能降低肌肉被致病菌污染的风险，因此，低温贮藏能有效抑制细菌的增殖，延长对虾的可接受期。

2.3生物胺含量变化

在0、4、25℃下贮藏0、2、4、6、8、10 d，测定中国对虾体内生物胺变化的情况，结果见表3。

表3不同贮藏条件下中国对虾产生生物胺的变化Table 3 Changes in biogenic amines rating of Chinese shrimp during different storage condition

表3可见，生物胺总量随着贮藏时间的延长而增加。在0、4℃下贮藏，腐胺和尸胺是变化最显著的生物胺，贮藏初始仅检出有少量亚精胺，至贮藏终期酪胺和亚精胺变化呈轻微波动的规律，0℃下贮藏，腐胺和尸胺的质量分数第10天达到（206.48±14.19）mg/kg和（162.45±18.13）mg/kg；4℃下贮藏，腐胺和尸胺的质量分数第10天达到（397.48±14.19）mg/kg和（201.95± 15.84）mg/kg，在对虾感官等级变化时，腐胺和尸胺的质量分数上升明显，0℃和4℃两种贮藏温度相比，中国对虾生物胺变化差异显著（P＜0.05）。虾仁在经过去壳、头、消化腺后，单位含菌量上要低于整虾，这在一定程度上会影响到低温贮藏时腐胺和尸胺的质量分数，实验数据与预期结果相符。25℃下贮藏，酪胺是主要生物胺，其质量分数在第2天急速升高到（343.31± 13.24）mg/kg，贮藏终期高达（675.66±20.25）mg/kg，远超静脉注射小鼠LD50229 mg/kg限值，足以危及人体生命安全，FDA认为，酪胺的安全阈值建议参考上限为100 mg/kg～800 mg/kg[17]，而腐胺和尸胺的质量分数至第10天仅为（191.82±10.64）mg/kg和（49.44±4.02）mg/kg。针对高温贮藏会改变细菌优势菌种的种类，进而影响主要生物胺产生的现象，Guizani[18]分析了生物胺产生菌的性质，认为这些菌一般为嗜温菌，所以20℃更加容易产生生物胺，相关研究有待进一步深入。在0、4、25℃下贮藏，组胺、章鱼胺和苯乙胺始终没有检出。

亚精胺由精氨酸脱羧产生，是生物体内的必需物质，贮藏初期呈上升趋势，到第4天最高，然后持续下降。有学者认为在腐胺的产生过程中，精氨酸很有可能被利用作为腐胺的前体物质，从而竞争性抑制精氨酸的产生[19]。甲壳类的肌肉中几乎没有肌肽和游离组氨酸，因而不太可能会产生组胺，但是其肌肉中含有大量的磷酸精氨酸，精氨酸与鸟氨酸之间可以相互转化，因此能产生大量的腐胺。Rezaei等研究表明，当假单胞菌为主要腐败菌时其主要的生物胺为尸胺和腐胺[20]。Huss发现假单胞菌需氧、嗜冷生长，能分泌嗜铁素等物质抑制其他竞争细菌的生长，同时分泌高活性蛋白酶和脱羧酶，因此被认为有氧冷藏特定腐败菌[21]。实验结果显示，相同温度下贮藏不同形态的虾仁和整虾，两者间差异显著（P＜0.05），虾仁能有效降低活菌数，进而抑制生物胺产生，对对虾贮藏的防腐保鲜有积极意义。

3　结论

中国对虾的感官等级、pH、菌落总数和生物胺总量的变化规律具有一致性，可作为鲜度评价的参考指标。不同形态的对虾在0、4、25℃下贮藏，整虾的可接受期为5、4、1 d，虾仁可接受期为7、5、1 d。中国对虾低温贮藏产生的主要生物胺是腐胺和尸胺，常温贮藏产生大量酪胺，细菌是造成虾体内生物胺累积的主要原因。

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Produce Different Forms of Chinese Shrimp during Storage Analysis of Changes in Biogenic Amines

HU Li-yuan，SUN Gao-ying，LIAO He-jing
（Dongxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

Abstract：In order to improve the level of imports and exports of shrimp risk monitoring，measuring different forms of Chinese shrimp produced changes in biogenic amines during storage，combined with sensory testing using reverse-phase high performance liquid chromatography，pH and the total number of colonies of the test results，the analysis process and the reasons for corruption shrimp . The results show that at 0℃and 4℃storage，putrescine and cadaverine was most remarkable，storage first 10 days quality scores were（206.48± 14.19）mg/kg，（162.45±18.13）mg/kg and（397.48±14.19）mg/kg，（201.95±15.84）mg/kg；mainly biogenic amines produced under 25℃storage is tyramine，storage 10 days the mass fraction of（675.66±20.25）mg/kg，followed by putrescine and cadaverine. Determine the different forms of shrimp at 0，4，25℃storage，whole shrimp acceptable period of 5，4，1 d，shrimp acceptable period of 7，5，1 d，bacteria are the main cause of shrimp in vivo accumulation of biogenic amines .

Key words：Chinese shrimp；biogenic amines；corruption；bacteria；storage

收稿日期：2014-10-09

作者简介：胡礼渊（1979—），男（汉），助理工程师，本科，研究方向：水产品检测。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.043