血必净对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤的保护作用及其机制

2016-04-18袁伟燕黄中伟陈卫昌沈雁波苏州大学附属第一医院江苏苏州5006南通大学附属医院

山东医药 2016年8期

袁伟燕，黄中伟，陈卫昌，沈雁波( 苏州大学附属第一医院，江苏苏州5006；南通大学附属医院)

袁伟燕1，2，黄中伟2，陈卫昌1，沈雁波2(1 苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006；2 南通大学附属医院)

摘要：目的探讨血必净对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肝损伤的保护作用及其对肝脏信号转导与转录激活因子(p-STAT3)表达的影响。方法选择雄性SD大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、血必净组，每组24只。模型组、血必净组采用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射制备重症SAP大鼠模型，血必净组制模后腹腔内一次性注射血必净4 mL/kg。假手术组打开腹腔，模拟上述操作，但不注射药物。模型组、血必净组于制模3、6、12 h随机取大鼠8只，假手术组同时间各取大鼠8只，心脏穿刺取血，检测血清ALT、AST。取血后处死，取肝组织行HE染色，观察肝组织病理改变；免疫组化染色及Western blotting法检测肝脏p-STAT3蛋白表达。结果模型组、血必净组制模后各时间点血清ALT、AST水平均高于假手术组同期，且制模12 h明显高于制模3、6 h(P均<0.05)；血必净组制模后各时间点血清ALT、AST水平均低于模型组同期(P均<0.05)。肝组织病理观察显示，模型组、血必净组肝损伤程度重于假手术组，但轻于模型组。与模型组比较，血必净组肝脏p-STAT3蛋白表达明显降低(P均<0.05)。结论血必净对重症SAP大鼠肝损伤具有一定保护作用，其机制可能与抑制p-STAT3表达有关。

关键词：重症急性胰腺炎；肝损伤；血必净；肝脏信号转导与转录激活因子；大鼠

重症急性胰腺炎(SAP)是临床常见的急危重症，早期即可引起肺、肾、肝等多器官功能衰竭(MODS)，病死率高达40%[1]。肝脏是重症SAP最常累及的胰外器官之一。血必净以血府逐瘀汤为底方，主要成分为红花、川穹、丹参、赤芍等，具有活血凉血、解毒止痛之功效。现代药理学研究表明，血必净可抑制炎症介质或细胞因子的释放，减轻炎症反应损伤[2，3]，对SAP本身及其累及的肝损伤可能具有保护作用，但其作用机制尚未明确。2011年11月～2015年1月，我们观察了血必净对重症SAP大鼠肝损伤的保护作用，现分析结果，并探讨其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1材料健康雄性SD大鼠72只，清洁级，鼠龄8～10周，体质量250～300 g，由南通大学医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(苏)2008-0010。所有大鼠分笼喂养，自由进食和摄水，明暗周期12 h。全自动生化分析仪，德国西门子公司；JY92-2D超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所；蛋白电泳仪、图像分析系统，美国Bio-Rad公司。血必净注射液(规格：10 mL/支)，天津红日药业股份有限公司；牛磺胆酸钠，美国Sigma公司；兔抗大鼠p-STAT3一抗，美国Bioworld公司；PVDF膜，美国Millipore公司；兔抗大鼠β-actin抗体、山羊抗鼠IgG二抗，美国Santa Cruz公司。

1.2动物分组及模型制备随机将SD大鼠分为假手术组、模型组及血必净组，每组24只。模型组、血必净组参照Lankisch等[4]的方法，术前禁食12 h、不禁水，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，以0.1 mL/min速率向胆胰管内注入5%牛磺胆酸钠(0.1 mL/100 g)制备重症SAP模型。血必净组制模后腹腔内一次性注射血必净注射液(4 mL/kg)。假手术组打开腹腔后模拟上述操作，但不注射药物。

1.3相关指标观察

1.3.1肝功能指标各组分别于制模3、6、12 h随机取8只，乙醚麻醉，心脏穿刺取血3～5 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min，取血清，-20 ℃冰箱冻存。应用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST。

1.3.2肝组织病理变化各组取血后处死，取新鲜肝左叶，4%甲醛溶液固定24 h，组织经脱水、透明、浸蜡，包埋制成蜡块，4 μm厚切片，烤片后二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、HE染色。光镜下观察肝组织病理形态学变化。

1.3.3肝组织p-STAT3表达①免疫组化法。切片烘烤脱蜡，抗原修复，每张切片加50 μL 3% H2O2，室温下孵育10 min，PBS冲洗；每张切片加50 μL兔抗大鼠单克隆抗体p-STAT3，4 ℃过夜，PBS冲洗；每张切片加50 μL聚合物增强剂，室温下孵育20 min，PBS冲洗；每张切片加50 μL抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30 min，PBS冲洗；每张切片加50 μL新鲜配制的DAB，室温下显色5 min，蒸馏水冲洗。一抗的工作浓度为1∶100，以PBS作为阴性对照。p-STAT3阳性染色定位于细胞质及细胞核，呈淡黄色至棕褐色。②Western blotting法。取新鲜肝组织200 mg，RIPA裂解液裂解后冰浴下超声匀浆，4 ℃ 10 000 r/min离心15 min，取上清液，-80 ℃冰箱冻存。Bradford法蛋白定量，每孔加样量30 μg，SDS-PAGE电泳；蛋白转移至PVDF膜，新鲜配制的含5% BSA TBST液室温下封闭2 h，加入兔抗大鼠p-STAT3多克隆抗体(1∶500)和兔抗大鼠β-actin抗体(1∶500)，4 ℃过夜；将膜取出，TBST液冲洗5 min×3次，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗孵育2 h；ECL显影，BandScan5.0凝胶电泳图像分析软件行条带灰度扫描，以β-actin为内参对p-STAT3灰度值行半定量分析。以上实验重复3次，取平均值。

2结果

2.1各组血清ALT、AST水平比较见表1。

表1　各组ALT、AST水平比较

注：与假手术组同期比较，*P<0.05；与模型组同期比较，#P<0.05；与同组3、6 h比较，△P<0.05。

2.2各组肝组织病理变化光镜下，假手术组各时间点肝组织结构基本正常，无坏死、出血及中性粒细胞、淋巴细胞浸润；模型组制模3 h开始可见肝窦充血，肝细胞明显肿胀，肝索扭曲，细胞质空泡形成，肝细胞坏死，汇管区有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，肝脏毛细血管充血、出血明显，以制模12 h最严重；血必净组各时点肝窦充血、肝细胞坏死以及汇管区中性粒细胞、淋巴细胞浸润等均较模型组明显减轻。

2.3各组肝组织p-STAT3表达比较免疫组化染色结果显示，假手术组肝组织p-STAT3不表达或弱阳性表达。模型组制模3 h可见少量p-STAT3阳性细胞，主要定位于细胞质；制模6 h肝组织p-STAT3表达开始增强，着色逐渐加深；制模12 h肝组织p-STAT3表达达高峰，胞质和胞核均可见阳性表达,以胞核为主。血必净组各时间肝组织p-STAT3表达较SAP组显著降低，阳性细胞减少，着色减弱。各组p-STAT3蛋白表达见表2。

表2　各组肝组织p-STAT3蛋白表达比较

注：与假手术组同期比较，*P<0.05；与模型组同期比较，#P<0.05；与同组3、6 h比较，△P<0.05。

3讨论

SAP可产生大量炎症介质和细胞因子，如TNF-α、IL-6等。这些炎症介质和细胞因子可产生级联效应，引起全身炎性反应综合征(SIRS)或MODS。肝脏作为胰腺血液回流的第一站，又是多种细胞因子的灭活场所，因而成为SAP累及的主要胰外脏器。肝损害程度可反映SAP的严重程度[5]，二者呈正相关[6]。一方面严重的肝功能损伤可发展为肝功能衰竭，增加SAP的病死率；另一方面肝功能损伤后，肝脏的解毒作用明显下降，致病因子容易侵入体循环，从而对全身其他器官造成损伤。酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活因子(JAK/STAT)通路是多种炎症细胞因子信号转导的共同通路之一[7]，由一系列蛋白激酶瀑布组成。JAK2和STAT3是该家族中的重要成员，多种细胞因子包括NF-κB、TNF-α、IL-6等，可诱导JAK2活化，导致下游STAT3酪氨酸磷酸化为p-STAT3，最终引起一系列生化反应。p-STAT3表达水平能反映STAT3活化程度[8]。有研究表明，SAP肺损伤与STAT3活化密切相关[9～11]。亦有研究发现，STAT3可能在SAP早期即参与胰腺和肝组织的炎症反应，抑制STAT3途径可保护胰腺、肝组织损伤，其机制与调控JAK/STAT信号转导途径有关[12]。

血必净以血府逐瘀汤为底方，主要成分为红花、川穹、丹参、赤芍等，具有行气活血、清热凉血、解毒止痛之功效，可抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应，常用于治疗脓毒血症、SIRS及MODS等。创伤性脓毒症发生时，细菌感染导致机体出现严重的SIRS，炎症细胞因子级联爆发，导致包括肝脏在内的各脏器继发性损伤。早期给予血必净可明显减轻炎症反应程度，增加肝脏蛋白合成能力，减少肝脏损伤[13，14]。临床研究发现，血必净对SAP并发的肝损伤有明显治疗作用[15，16]，但目前其作用机制尚未完全清楚。

本研究结果显示，SAP组肝组织病理损伤明显，各时间点血清ALT、AST水平明显高于假手术组，制模12 h达高峰；经血必净治疗后，血清ALT、AST水平均明显下降，肝组织病理改善明显，提示血必净对SAP合并的肝损伤有一定治疗作用。本研究结果显示，SAP组早期肝组织中p-STAT3表达明显上调，随作用时间延长，其表达逐渐升高，至12 h达高峰；血必净组各时间点肝组织p-STAT3表达均较SAP组相应时间点明显降低，提示p-STAT3活化可能参与了SAP肝损伤的病理过程，血必净可能通过下调肝组织p-STAT3表达对SAP肝损伤发挥一定保护作用，但其具体机制尚需进一步研究。

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(收稿日期：2015-10-12)

中图分类号：R657.5

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)08-0030-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.011