二甲双胍对宫颈癌Hela细胞Twist及E-cadherin表达的影响及机制

汤轶，孙晓红

(南华大学附属南华医院，湖南衡阳421000)



二甲双胍对宫颈癌Hela细胞Twist及E-cadherin表达的影响及机制

汤轶，孙晓红

(南华大学附属南华医院，湖南衡阳421000)

摘要：目的观察二甲双胍处理后宫颈癌Hela细胞JAK/STAT3信号通路调节靶基因Twist及上皮-间质转化(EMT)标志物E-cadherin的表达变化，并探讨其机制。方法 宫颈癌Hela细胞培养后分别经IL-6(IL-6组)、二甲双胍(二甲双胍组)及IL-6+二甲双胍(IL-6+二甲双胍组)处理48 h，未处理细胞作对照组，观察各组细胞形态学变化，检测细胞坏死情况，Western blotting法检测p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表达，RT-PCR法检测Twist、E-cadherin mRNA表达。结果IL-6组Hela细胞向间质细胞表型转变，而IL-6+二甲双胍组Hela细胞未向间质细胞表型转变且细胞坏死。IL-6组、IL-6+二甲双胍组p-STAT3、Twist、E-cadherin蛋白表达及Twist、E-cadherin mRNA表达与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05)，而二甲双胍组以上指标与对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 二甲双胍可通过阻断JAK/STAT3信号通路降低宫颈癌Hela细胞Twist及E-cadherin的表达。

关键词：宫颈肿瘤；二甲双胍；白细胞介素6；JAK/STAT3信号通路；上皮-间质转化

在肿瘤细胞中，多种因素可持续激活JAK/STAT3信号通路，促进肿瘤的发生和发展。细胞因子如IL-6，通过激活STAT3，促进肿瘤细胞上皮-间质转化(EMT)，增强肿瘤细胞对免疫系统的侵袭作用[1~3]。肿瘤细胞EMT特征性表现是E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达缺失，最终使细胞黏附能力下降，侵袭和迁移能力增强。近年来研究发现，二甲双胍具有抗肿瘤作用及降低肿瘤发病风险，并能提高肿瘤患者的存活率[4~8]。但是，二甲双胍的抗肿瘤机制尚不完全清楚。2014年1~10月，本研究观察二甲双胍对宫颈癌Hela细胞Twist及E-cadherin表达的影响，并探讨其机制。

1材料与方法

1.1材料RPMI1640(Hyclone)，胎牛血清(四季青公司)，胰蛋白酶、RIPA裂解液(碧云天公司)，人IL-6(Peprotech)，二甲双胍(Sigma)，死活细胞染色试剂盒(凯基)；单克隆抗体Twist、E-cadherin、p-stat3(Abcam)，RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR反应试剂盒(Qiagen)；CO2培养箱(Thermo Forma)；倒置显微镜 IX71、荧光显微镜(Olympus)；生物安全柜(Thermo Scientific)；逆转录及PCR仪(Bio-Rad)。

1.2Hela细胞培养Hela细胞由南华大学肿瘤研究所提供，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37 ℃、5% CO2孵箱中培养，待细胞长满6孔板后，分别采用含50 ng/mL IL-6(IL-6组)、10 mmol/L二甲双胍(二甲双胍组)培养基培养48 h，先用含50 ng/mL IL-6的培养基培养24 h，再用含10 mmol/L二甲双胍(IL-6+二甲双胍组)的培养基继续培养24 h，对照组则采用单纯培养基培养48 h，于倒置显微镜下观察细胞形态变化。

1.3细胞染色各组细胞处理48 h，按死活细胞染色试剂盒要求进行染色，活细胞呈现绿色荧光，坏死细胞呈现橙色荧光，荧光显微镜下观察各组细胞染色情况。

1.4细胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表达检测采用Western blotting法。各组细胞处理48 h，提取总蛋白，测定蛋白浓度，上样，跑胶，转膜，封闭，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，显色，成像。用Image Lab软件测量目标蛋白条带的灰度值，与内参的灰度值进行比较，取对比值作为目标蛋白相对表达量。以上实验重复3次取均值。

1.5细胞Twist、E-cadherin mRNA表达检测采用RT-PCR法。各组细胞处理48 h，按照试剂盒要求提取总RNA，逆转录为cDNA，并按以下条件进行PCR：95℃ 5 min, 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，扩增40个循环。其中GAPDH为内参基因， Twist引物序列F：5′-CGTTTCCAGGAGGCCTGGCG-3、R：5′-GCGAGA-CTGGCGAGCTGGAC-3；E-cadherin引物序列F：5′-GGGTTATTCCTCCCATCAGC-3、R：5′- ATTCGGGCTTGTTGTCATTC-3；GAPDH引物序列F：5′-CTTCTA-CAATGAGCTGCGTG-3,R：5′-TCATGAGGTAGTCAGT-CAGG-3。以2-ΔΔCt公式计算Twist、E-cadherin mRNA相对表达量。

2结果

2.1各组细胞形态学变化Hela细胞经处理48 h，对照组细胞椭圆形，紧密排列；IL-6组细胞间隙明显增宽，细胞呈纺锤状和长梭形，排列散乱，可见Hela细胞向间质细胞表型转变；二甲双胍组细胞形态圆形，细胞成团堆积，较多凋亡细胞漂浮；IL-6+二甲双胍组细胞形态圆形、长梭形，细胞核疏松，细胞成团漂浮。

2.2各组细胞染色结果Hela细胞经处理48 h，对照组、IL-6组只有少量细胞坏死，二甲双胍组有较多细胞坏死，而IL-6+二甲双胍组全为坏死细胞(细胞成片漂浮)。

2.3各组细胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表达比较见表1。

表1　各组细胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.4各组细胞Twist、E-cadherin mRNA表达比较见表2。

表2　各组细胞Twist、E-cadherin mRNA

注：与对照组比较，*P<0.05。

3讨论

在肿瘤细胞中，细胞因子、生长因子、炎症因子等通过改变肿瘤微环境，调节细胞内信号转导，影响肿瘤的恶性转化。肿瘤微环境中重要的炎症因子，能通过与相应受体特异性结合，调节细胞信号转导，通过持续激活JAK/STAT3信号通路调节靶基因Twist及EMT相关标志物蛋白如E-cadherin表达，导致细胞向间质表型改变，促进肿瘤细胞侵袭、转移[1~3]。本研究发现，用重组人IL-6处理宫颈癌Hela细胞，出现细胞间隙增宽，呈纺锤状或长梭形，细胞核颜色变深，诱导Hela细胞向间质表型转变。在蛋白及基因表达水平，我们发现，用IL-6处理Hela细胞后，STAT3磷酸化水平升高，并使相关转录因子Twist蛋白及基因表达上调，EMT相关标志蛋白E-cadherin蛋白及基因表达下调，与相关研究[9]结果一致。

二甲双胍是临床广泛应用的抗2型糖尿病药物。有研究报道，二甲双胍能通过阻断JAK/STAT3信号转导，调节细胞凋亡及自噬相关基因的表达，调节与肝肿瘤细胞、乳腺癌细胞侵袭转移相关基因及蛋白的表达而逆转EMT，抑制肿瘤细胞侵袭转移，最终抑制肿瘤进展[3，10]。在肝癌细胞中，二甲双胍和蛋白激酶(AMPK)激活剂都能抑制IL-6诱导的炎症反应，并且能通过腺苷-磷酸激活AMPK途径调节IL-6/gp130/JAK/STAT3信号转导，从而调节促炎症因子的表达[11~13]。本研究发现，IL-6+二甲双胍组宫颈癌Hela细胞形态由狭长变圆，细胞核松散，出现核碎裂，坏死细胞大量漂浮，比单独使用二甲双胍对Hela细胞凋亡的促进作用更显著。可见，单独使用二甲双胍处理Hela细胞，不能明显降低STAT3磷酸化水平、Twist蛋白及Twist mRNA表达、上调E-cadherin蛋白及mRNA表达。IL-6处理Hela细胞后加入二甲双胍，使STAT3磷酸化水平降低、Twist蛋白及mRNA表达降低，逆转Hela细胞EMT，与文献报道一致；但是E-cadherin蛋白及mRNA表达较对照组不升反降，与文献研究结果相反。我们分析，用IL-6、二甲双胍联合处理宫颈癌Hela细胞，通过抑制JAK/STAT3信号通路，诱导细胞坏死，导致总体细胞量减少，使细胞总蛋白及总mRNA减少，最终导致E-cadherin蛋白及mRNA表达降低。以上研究结果证明，二甲双胍以JAK/STAT3信号通路为靶点，阻断JAK/STAT3信号转导，抑制宫颈癌细胞EMT。

综上所述， IL-6能促进Hela细胞向间质细胞表型转变，而二甲双胍可通过JAK/STAT3信号通路逆转宫颈癌Hela细胞EMT，为临床二甲双胍治疗宫颈癌提供了新思路，但其具体机制及可行性还有待进一步研究证明。

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(收稿日期：2015-10-11)

中图分类号：R737.33

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)09-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.011

通信作者：孙晓红(E-mail:csxtt@sina.com)