肺癌肿瘤抑制因子1对膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用及机制

王尚任，陈业刚，杨永姣，刘莉，刘晓强，陈少峰，孙光

(1天津医科大学第二医院，天津300211；2天津市泌尿外科研究所)



肺癌肿瘤抑制因子1对膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用及机制

王尚任1，陈业刚1，杨永姣1，刘莉2，刘晓强1，陈少峰1，孙光1

(1天津医科大学第二医院，天津300211；2天津市泌尿外科研究所)

摘要：目的观察肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)对膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用，并探讨其作用机制。方法 将TSLC1过表达人膀胱癌T24细胞株(Ad-TSLC1-T24组)、空载体对照T24细胞株(Ad-T24组)及空白对照T24细胞株(T24组)种植于裸鼠皮下，绘制肿瘤生长曲线，种植细胞5周处死全部裸鼠留取肿瘤组织标本，测量肿瘤体积，称量瘤重，计算抑瘤率，光镜观察移植瘤组织病理变化，RT-PCR法检测移植瘤组织中TSLC1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)mRNA表达，Western blotting法检测移植瘤组织中TSLC1、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达。结果肿瘤生长曲线显示Ad-TSLC1-T24组移植瘤生长明显慢于Ad-T24组及T24组，种植细胞5周Ad-TSLC1-T24组肿瘤体积及质量低于Ad-T24组及T24组(P均<0.05)，抑瘤率高于Ad-T24组(P<0.05)。HE染色结果显示，Ad-TSLC1-T24组移植瘤细胞出现明显的核固缩、核碎裂等凋亡现象。与Ad-T24组、T24组比较，Ad-TSLC1-T24组移植瘤中TSLC1、Caspase-3 mRNA及蛋白相对表达量增加，Bcl-2 mRNA及蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。结论 TSLC1过表达可抑制膀胱癌裸鼠移植瘤生长，其机制可能与上调Caspase-3表达和下调Bcl-2表达促进了肿瘤细胞凋亡有关。

关键词：膀胱肿瘤；肺癌肿瘤抑制因子1；移植瘤；B淋巴细胞瘤-2基因；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3

肺癌肿瘤抑制因子1(TSLC1)是一种抑癌基因，是细胞黏附分子中免疫球蛋白超家族成员。TSLC1表达缺失与多种恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关。我们的前期研究也发现，TSLC1表达的异常与膀胱癌的发生发展及预后存在密切关系。2014年11月~2015年1月本研究将过表达TSLC1基因的T24膀胱癌细胞系种植于裸鼠皮下，观察TSLC1在体内环境下对膀胱癌移植瘤生长的影响，探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1材料人膀胱癌慢病毒介导的TSLC1过表达T24细胞株(Ad-TSLC1-T24)及空载体对照T24细胞株(Ad-T24)由上海汉恒生物公司构建。BALB/c雌性裸鼠18只(体质量15~20 g、5周龄)购买于中国食品药品检定研究所，所有动物饲养于中国医学科学院生物工程医学研究所。总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自美国GeneCopoeia公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。鼠抗人TSLC1单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体及鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)单克隆抗体购自美国Abnova公司，二抗羊抗鼠IgG抗体、GAPDH内参抗体及BCA蛋白测定试剂盒购自中国康为世纪公司。

1.2细胞培养及动物模型建立将Ad-TSLC1-T24、Ad-T24、空白对照T24培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱下培养传代。取对数生长期的细胞，PBS洗涤后，调整细胞浓度至1×107/mL，用于接种裸鼠。18只裸鼠随机分为3组，每组6只，分别接种Ad-TSLC1-T24(Ad-TSLC1-T24组)、Ad-T24(Ad-T24组)、T24(T24组)，各自取0.2 mL细胞悬液接种于裸鼠前肢肩胛部皮下。

1.3膀胱癌移植瘤生长情况观察肿瘤形成后每隔5天使用游标卡尺测量肿瘤长径与短径,记录数据并计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。接种细胞5周，采用脱颈法处死全部裸鼠，迅速完整剥离肿瘤，测量肿瘤体积，并利用微量天枰称量瘤重，计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(空白组肿瘤质量-实验组肿瘤质量)/空白组肿瘤质量×100%。

1.4移植瘤病理变化观察取各组部分移植瘤标本，使用10%甲醛固定，石蜡包埋后切片，制成5 μm切片，再经烤片、脱蜡、HE染色、脱水、封片等操作后完成病理制片，在光学显微镜下观察各组移植瘤病理改变。

1.5移植瘤组织TSLC1、Bcl-2及Caspase-3 mRNA表达检测采用RT-PCR法。取各组部分移植瘤标本，严格按照总RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒说明提取总RNA，进行反转录。RT-PCR反应采用10 μL体系，以管家基因GAPDH为标准化样品，严格按照RT-PCR试剂盒说明书进行操作，TSLC1上游引物为5′-CCCCAGCCTGTGATGGTA-3′、下游引物为5′-GGATAGTTGTGGGGGGATCGT-3′，Bcl-2上游引物为5′-GTATGATAACCGGGAGATCG-3′、下游引物为5′-AGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′，Caspase-3上游引物为5′-CTGGACTGCGGTATTGAGAC-3′、下游引物为5′-CCGGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′，GAPDH上游引物为5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′、下游引物为5′-AGCCTTCTCC ATGGTGGTGAAGAC-3′，实验结果以Ct值表示，每组标本重复检测3次，待测样品目的基因的相对表达量为2-ΔΔCt。ΔCt=待测样品目的基因Ct值-待测样品GAPDH Ct值。

1.6移植瘤组织TSLC1、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达检测采用Western blotting法。取各组移植瘤组织，在冰上裂解匀浆，4 ℃离心，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度后将各组蛋白浓度调至同一水平，配制分离胶及浓缩胶，蛋白加热变性后每孔加入40 μg进行电泳，电泳后湿转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭过夜，室温孵育一抗(1∶1 000)2 h，洗膜，室温孵育二抗(1∶5 000)1.5 h，洗膜，以GAPDH作为内参，用新鲜配制的ECL发光液均匀覆盖于膜上，反应5 min，凝胶成像分析系统下显影、定影。使用Image-Pro Plus 5.0软件分析蛋白表达的灰度值，与内参基因比较计算蛋白相对表达量。

2结果

2.1TSLC1对人膀胱移植瘤生长的影响3组抑制瘤体积生长曲线见图1，Ad-TSLC1-T24组移植瘤生长速度明显慢于Ad-T24组、T24组，Ad-T24组、T24组肿瘤生长速度比较差异不明显。接种细胞5周，T24、Ad-TSLC1-T24、Ad-T24组肿瘤体积分别为(1 851±405)、(985±264)、(1 687±326)mm3，肿瘤质量分别为(2.1±0.9)、(1.1±0.4)、(1.8±0.5)g；Ad-TSLC1-T24组肿瘤体积、质量均低于T24、Ad-T24组，P均<0.05；T24组与Ad-T24组肿瘤体积、质量比较，P均>0.05。Ad-TSLC1-T24组抑瘤率为47.6%，Ad-T24组抑瘤率为14%，两组比较，P<0.05。

图1　3组移植瘤体积生长曲线

2.2各组移植瘤病理改变Ad-TSLC1-T24组移植瘤细胞生长较差，细胞大小不一，形态不整，细胞核出现核固缩及核碎裂等凋亡表现，T24组及Ad-T24组移植瘤细胞生长较好。

2.3各组裸鼠移植瘤组织中TSLC1、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达比较见表1。

表1　各组移植瘤组织中TSLC1、Bcl-2及Caspase-3

注：与Ad-TSLC1-T24组比较，*P<0.05。

2.4各组裸鼠移植瘤组织中TSLC1、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较见表2。

表2　各组移植瘤组织中TSLC1、Bcl-2及Caspase-3 蛋白的

注：与Ad-TSLC1-T24组比较，*P<0.05。

3讨论

膀胱癌是泌尿外科临床常见的肿瘤之一，其发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段、多环节的病理变化过程，在非肌层浸润性膀胱癌中有55%~60%的患者在治疗后复发或进展，严重影响患者预后，是膀胱癌临床治疗中面临的主要难题[1,2]。因此，对膀胱癌的发病机制进行深入研究，寻找能够用于膀胱癌早期诊断、复发监测或治疗的肿瘤分子标志物仍是目前研究的重点之一。

TSLC1是Gomyo等在1999年分析人染色体11q23.2区域发现的一种肿瘤抑制基因。TSLC1属于免疫球蛋白超家族，可转录4.4 kb或1.6 kb的前体mRNA，翻译成442个氨基酸组成的跨膜蛋白。TSLC1蛋白胞外区含有373个氨基酸，并由二硫键连接形成3个免疫球蛋白C2型结构域，跨膜区为一疏水性的α螺旋结构域，胞质区羧基端为PDZ和FERM结合模体，TSLC1通过PDZ模体与MPP3蛋白相互作用、通过FERM结合模体与DAL-1/4.1B蛋白发生作用，激活下游信号通路，参与细胞间黏附、细胞运动、免疫调节、信号转导等多种生物学效应[3~5]。TSLC1的失活或异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关[6~8]，TSLC1通过抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡起到抑癌作用，并可介导细胞间黏附、改变肿瘤细胞生长特性、抑制上皮间转化，在抑制上皮来源的恶性肿瘤中起重要作用[9,10]。本课题组前期研究也发现，TSLC1基因在膀胱癌组织中低表达，并与膀胱癌的分级分期及侵袭能力密切相关[2]，并证实TSLC1启动子甲基化与TSLC1的失活关系密切[11]。目前，TSLC1对膀胱癌细胞的抑制作用及机制尚不清楚。本研究结果显示，TSLC1过表达可明显抑制肿瘤的生长，TSLC1过表达组膀胱癌移植瘤体积和质量明显低于其他两组，抑瘤率为47.6%；光镜观察显示肿瘤细胞的增殖受到限制，并出现核固缩、核碎裂等细胞凋亡表现。说明TSLC1的过表达可引起膀胱癌肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。

细胞凋亡受多种基因的调控，与Caspases家族和Bcl-2家族密切相关， Caspases-3在细胞凋亡通路中处于中心环节，其活化后能特异性切割蛋白底物的氨基酸序列，破坏细胞结构，导致细胞凋亡[5,8]。研究发现，Caspase-3参与了肿瘤细胞发生发展过程中细胞凋亡异常的变化[12]。Bcl-2是一种癌基因，具有阻断细胞凋亡的作用，Bcl-2的过度表达与肿瘤的发生发展关系密切，可使DNA受损的细胞持续生存，促进肿瘤的发生发展[13,14]。目前认为Bcl-2可作用于Caspase-3的上游通路，从而抑制Caspase-3作用的发挥[12,15]。本研究通过过表达TSLC1基因的T24细胞系构建裸鼠移植瘤模型，并利用RT-PCR和Western blotting法检测裸鼠移植瘤中Caspase-3、Bcl-2 mRNA及蛋白表达的变化，探究TSLC1促进肿瘤细胞凋亡的机制，结果显示，TSLC1过表达的同时伴随着Bcl-2表达量的降低及Caspase-3表达量的升高，因此我们推断，TSLC1过表达可以下调Bcl-2表达并上调Caspase-3表达，从而促进了膀胱癌细胞的凋亡，抑制了膀胱癌移植瘤生长。然而，TSLC1发挥抑癌作用的具体机制及其分子通路尚需进一步研究。

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(收稿日期：2015-10-22)

中图分类号：R737.14

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)09-0034-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.012

通信作者：刘晓强(E-mail:xiaoqiangliu1@163.com)

基金项目：天津市科委自然科学基金重点项目(12JCZDJC23700)。