全血法流式细胞术检测中性粒细胞抗体方法建立及临床初步应用

王 璇 朱晴晖

全血法流式细胞术检测中性粒细胞抗体方法建立及临床初步应用

王 璇 朱晴晖

目的 建立适用于临床的流式细胞术检测中性粒细胞（PMN）抗体的方法，确定健康人PMN CD16b和CD177两种抗原的参考范围，并初步用于检测抗PMN抗体。方法 应用流式细胞术，以前向散射和侧向散射参数区分全血标本中的淋巴细胞和粒细胞，设定粒细胞门，用CD16b-PE和CD177-APC单克隆抗体分别检测中性粒细胞表面表达CD16b和CD177抗原的细胞的百分率，以此作为判断检测对象血液中抗CD16b或CD177抗体存在与否的依据。结果 分别确定了健康人群PMN表达CD16b和CD177的参考范围（＞x--2s）。心脑血管疾病患者3例中CD16b和CD177抗体均阳性者2例，淋巴瘤患者1例CD16b和CD177抗体均阳性，1例巨幼细胞性贫血患者检出CD16b抗体阳性，慢性PMN减少症患者6例中CD16b抗体阳性1例、CD16b和CD177抗体均阳性1例；自身免疫性疾病患者4例、甲状腺功能亢进、贫血患者和化疗后PMN减少的白血病患者各1例均未检出CD16b或CD177抗体阳性。结论 流式细胞术检测抗中性粒细胞CD16b和CD177抗体的简便快捷，适用于自身免疫性中性粒细胞减少症的实验诊断和鉴别诊断。

自身免疫性中性粒细胞减少症；中性粒细胞抗体；流式细胞术

自身免疫性中性粒细胞减少症（autoimmune neutropenia，AIN），是一组由中性粒细胞抗体介导的粒细胞减少（＜10岁儿童外周血中性粒细胞绝对值低于1.5×109/L，成人＜2.0×109/L）和粒细胞缺乏（粒细胞绝对值＜0.5×109/L）［1］。因患者体内存在中性粒细胞特异性抗原的抗体，导致中性粒细胞（PMN）在外周血或通过脾脏的时候破坏，或由补体介导的PMN溶解作用使粒细胞减少。

PMN表面有多种抗原，目前已发现的有HNA-1a、HNA-1b、HNA-1c、HNA-2a、HNA-2b、HNA-3a、HNA-4a和HNA-5a。在CD系统的命名中HNA-1即为CD16b，HNA-2a即为CD177，HNA-4a为 CD11a，HNA-5a为 CD11b。CD16b、CD11b、CD177是自身抗体结合位点，其中以抗HNA-1即抗CD16b的抗体为最多，约占30%［2］，因而本实验选择CD16b和CD177作为靶抗原。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

试剂：单克隆抗体：PE标记小鼠抗人CD16b（IgG2aκ），克隆号（CLB-gran 11.5）。APC标记小鼠抗人CD177（IgG1），克隆号（MEM-166）。以上抗体分别产自BD公司（USA）和Abcam公司（Hongkong）。溶血剂（Lysing Solution）和缓冲液（FASC Flow）都产自BD公司。

主要仪器：流式细胞仪：型号FACS Calibur，美国Becton-Dickinson公司产品。

1.2 标本来源

健康对照组：参加健康体检人员24例（男14例，女10例），WBC总数在5.9×109/L～9.9×109/L，中性粒细胞百分率在53%～68.7%，年龄21～56岁。

患者18例：年龄43～79岁（男5例，女13例），其中心脑血管疾病患者3例，淋巴瘤患者1例，慢性PMN减少患者6例，巨幼细胞性贫血1例，自身免疫性疾病（类风湿关节炎、皮肌炎、SLE）患者4例，甲状腺功能亢进、贫血和化疗后PMN减少的白血病患者各1例。

1.3 方法

1.3.1 检测过程 以EDTA-K2抗凝全血1 ml为标本，离心去血浆待用，并准备2支Falcon管：1号管为空白对照，不加任何抗体；2号管中加入PE标记的CD16b抗体10 μl，APC标记的CD177抗体5 μl，在两管中加入去浆血50 μl，轻混匀，室温避光静置20 min。加入溶血素1 ml，混匀，避光静置10 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清并加入PBS 1 ml，混匀，1 500 r/min离心5min，弃上清再加入PBS 300 μl重悬浮，上流式细胞仪检测。以前向散射与侧向散射参数区分淋巴细胞和粒细胞，确立粒细胞门，检测PMN表面表达CD16b和CD177的百分率。

1.3.2 参考范围 CD16b为＞（x--2s），CD177为＞（x--2s）。

1.3.3 结果比对 用该方法检测自体免疫性疾病伴或不伴PMN减少患者，以及非自身免疫性疾病患者共18例的全血标本中的PMN表面CD16b表达和CD177的表达百分率，与参考范围比较，以此判断患者血液中抗CD16b和CD177抗体存在与否。

2 结果

2.1 健康对照中性粒细胞表达CD16b和CD177的百分率

24例健康对照PMN表达CD16b和CD177的百分率的原始数据见表1。健康人流式细胞仪检测结果见图1。

图1 FCM测定健康人CD16b和CD177抗原散点图

2.2 临床患者检测结果

2.2.1 其他疾病中检测结果 心脑血管疾病患者3例中CD16b和CD177抗体均阳性者2例，淋巴瘤患者1例CD16b和CD177抗体均阳性（图2），1例有输血史的巨幼细胞性贫血患者检出CD16b抗体阳性，甲状腺功能亢进、贫血和化疗后PMN减少的白血病患者各1例均未检出CD16b或CD177抗体。

图2 FCM测定CD177抗原低百分率散点图

2.2.2 自身免疫性疾病中检测结果 4例自身免疫性疾病患者抗体均为阴性(注：自身免疫性疾病与其他疾病两组患者PMN数均在正常范围）。

2.2.3 慢性PMN减少症检测及治疗结果 6例慢性PMN减少症患者中检出CD16b抗体阳性1例（图3），检出CD16b和CD177抗体均阳性1例，该患者经激素治疗2周后，其WBC从3.5×109/L升 至4.3×109/L，PMN从2.16×109/L升 至3.0×109/ L，PMN表达CD16b和CD177抗原的百分率分别从93.85%和 42.65%，升至98.87%（在参考范围内）和47.7%。

图3 FCM测定CD16b抗原低百分率散点图注：提示该患者CD16b抗体阳性

3 讨论

在AIN的诊断上除明确规定了中性粒细胞减少的标准辅以骨髓检查外，主要采取的是除外诊断，缺乏自身免疫性中性粒细胞减少症的实验诊断标准。

本次研究中，6例慢性PMN减少症患者中检出2例存在抗PMN抗体［3-4］，虽然因病例数较少或因本实验选用的靶抗原并未全面覆盖AIN患者抗PMN自身抗体所有的靶抗原，因而尚不能完全反映该组患者抗PMN抗体的真实比例，但也说明在慢性PMN减少症患者中具有较高的抗PMN抗体阳性率（若扩大检测PMN表面抗原的指标，阳性率可能会更高）；此外，在PMN数均在参考范围的心脑血管疾病和淋巴瘤患者中PMN表面抗原表达率下降的比例相当高，这类患者未表现出PMN数低于参考值，这可能与他们的基数较高有关，也可能其PMN表面抗原表达与特殊的遗传背景有关。

表1 24例健康对照中性粒细胞表达CD16b和CD177的百分率

必须指出，在诊断AIN过程中需多次重复检测粒细胞特异性抗体才能确诊［5-7］。有报道SLE伴粒细胞减少的患者用流式细胞仪检测抗体阳性率为50%～60%，而一些中性粒细胞抗体阳性者的中性粒细胞却并不减少，因此一次粒细胞抗体阴性并不能排除AIN，需多次重复，并尽量扩大所测靶抗原的种类，而且因为一些自身免疫性疾病如SLE和Felty综合征存在免疫复合物很容易产生假阳性，生育多胎的妇女和多次输注血细胞的患者存在抗HLA抗体也容易产生假阳性［8］，在用抗PMN抗体诊断AIN时须综合考虑上述因素，才能有助于临床诊断和治疗。

［1］ 闫佩毅，张文龙，张骥，等． 流式细胞术检测抗中性粒细胞抗体方法的建立及临床初步应用［J］． 检验医学，2011，26（12）：826-831．

［2］ 郑玉梅． 全血法流式细胞术检测血小板抗体的效果观察［J］． 中国医药指南，2014，12（21）：245．

［3］ 梁振鸿，杜梅英，吴飞燕． 固相红细胞免疫吸附试验在临床中性粒细胞抗体筛检中的应用［J］． 中国输血杂志，2015，28（1）：69-71．

［4］ 贺政新，陈晶，王宪灵，等． 流式细胞术检测全血白细胞吞噬白念珠菌方法的建立和应用［J］． 细胞与分子免疫学杂志，2015，31（4）：470-473．

［5］ 唐曙明，杨自华． 抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体的研制及其检测试剂的初步应用［J］． 中国现代医学杂志，2015，25（13）：18-23．

［6］ 李海宁，李伟，吴惠毅． 中性粒细胞碱性磷酸酶研究进展［J］．临床检验杂志，2015，33（7）：524-526．

［7］ 董婷，李正发，欧阳红梅，等． 骨髓造血干/祖细胞自身抗体与免疫相关性全血细胞减少［J］． 中国组织工程研究，2013，17（19）：3603-3610．

［8］ 林果为，王小钦． 免疫性粒细胞减少症的诊断及治疗［J］． 中国实用内科杂志，2006，26（7）：487-489．

Establishment of the Method Detecting Antineutrophil Antibody in Whole Blood Sample With Flow Cytometry and its Primary Clinical Application

WANG Xuan ZHU Qinghui Clinical Laboratory Department，The People's Hospital of Putuo District，Shanghai 200060，China

Objective To establish the flow cytometry（FCM）method for clinical testing neutrophil antibodies，and determine the reference ranges of CD16band CD177 antigens on neutrophil of healthy control and primarily applicate it for testing neutrophil antibodies． Methods Application of flow cytometry，forward scattering and lateral scattering parameters to distinguish the whole blood samples of lymphocytes and granulocytes，to set the granulocyte gate，respectively percentage of neutrophil surface expression of CD16b and CD177 antigen in cells with CD16b-PE and CD177-APC monoclonal antibodies to the object in the blood was selected to detect the anti CD16b or anti CD177 antibody whether or not the basis． Results The reference ranges（＞x--2s）of the expression of CD16b and CD177 on neutrophil of healthy control were defined． There were both 2 cases of patients carried with anti-CD16b and 3 cases patients carried with anti-CD177 antibodies，cardiovascular or cerebrovascular diseases and also both anti-CD16b and anti-CD177 antibodies in a patient with lymphoma，a patient with megaloblastic anemia，1 case of 6 patients with chronic neutropenia were checkouted anti-CD16b antibodies，1 case of 6 patients with chronic neutropenia was checkouted both anti-CD16b and anti-CD177 antibodies．There were no anti-CD16b or anti-CD177 antibody in 4 patients with autoimmune diseases，1 patient with thyroid hyperfunction，1 patient with anemia and 1 patient with leukemia whose PMN decreased after chemotherapy． Conclusion The flow cytometry method for detecting anti-neutrophil CD16b and CD177 antibody is simple and fast and well applicable to autoimmune neutropenia’s laboratory diagnosis and differential diagnosis．

Autoimmune neutropenia，Antineutrophil antibody，Flow cytometry

R446．3

A

1674-9316（2016）22-0151-04

10．3969/j．issn．1674-9316．2016．22．091

普陀区人民医院检验科，上海 200060 通讯作者：朱晴晖，E-mail：372895147@qq．com