自噬因子Beclin 1和LC3表达与胃癌临床病理特征的相关性研究

黄俊玲　钟腾猛　黄赞松　李广志　周喜汉　何守搞

533000 广西右江民族医学院消化疾病研究所/附属医院(黄俊玲,黄赞松,李广志,周喜汉,何守搞)；533000 广西百色市人民医院(钟腾猛)



自噬因子Beclin 1和LC3表达与胃癌临床病理特征的相关性研究

黄俊玲钟腾猛黄赞松李广志周喜汉何守搞

533000 广西右江民族医学院消化疾病研究所/附属医院(黄俊玲,黄赞松,李广志,周喜汉,何守搞)；533000 广西百色市人民医院(钟腾猛)

【摘要】目的探讨自噬因子Beclin 1和LC3表达与胃癌临床病理特征的相关性。方法采用免疫组织化学方法，检测胃癌组织中自噬因子Beclin 1和LC3的表达情况。结果Beclin 1蛋白在胃癌组织中的表达率为42.5%(51/120)，在癌旁组织其表达率为93.3%(112/120)，两者比较有显著性差异(χ2=21.3，P<0.05)；LC3蛋白在胃癌组织中的表达率为90.0%(108/120)，明显高于癌旁组织的表达率(29.3%，34/120) ，两者有显著性差异(χ2=24.8，P<0.05)。Beclin 1和LC3蛋白表达与胃癌肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关，P<0.05。结论自噬因子Beclin1和LC3表达可能与胃癌的发生发展有关。

【关键词】胃癌；Beclin 1；LC3

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:530～532)

自噬是细胞死亡的1种形式，不但参与正常的生理反应，而且参与各种病理学过程[1]。但是自噬因子与胃癌病理相关性研究目前知之甚少，有待进一步研究[2-3]。本研究用免疫组化方法检测自噬因子在胃癌组织中的表达分布，探讨自噬因子在癌变过程中的作用以及临床意义。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

免疫组化所用单克隆抗体均购于CST公司，免疫组化试剂盒购于康成生物科技有限公司，显微成像系统购于Leica公司。

1.2标本及切片准备

从2010年至2013年，我院共收治120例胃癌患者，切取120例患者的癌组织及癌旁组织，患者均未行任何化疗、放疗或肿瘤其他疗法。所有标本均采用石蜡切片法进行处理和切片，每个标本做连续切片2张，每张厚约5 μm，均行HE染色。

1.3免疫组织化学染色

①石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01 mol/L pH 7.2～7.4,PBS洗5 min，冷风吹干，放入湿盒中。②滴加稀释的抗体，37 ℃ 30～60 min或4 ℃ 过夜。③PBS 洗2次，蒸馏水洗1次。④50%甘油缓冲液封片。⑤荧光显微镜下检查。⑥对照染色。阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。抑制试验，将标记抗体和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性(一步法)。或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清(例如特异性荧光标记抗体)，加了未标记特异性血清的切片因抗原抗体已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应(二步法)。切片标本经自来水充分冲洗后，苏木精复染细胞核，梯度乙醇脱水后，用二甲苯透明，中性树胶封片后，显微镜下观察并拍照。

1.4阳性结果判断标准

采用半定量评分对结果进行判定，在低倍镜和高倍镜下观察全片，根据染色强度和染色细胞所占比率的乘积来判定。染色强度(A)可以分为不染色、淡黄色、黄色、棕黄色。在×400高倍镜下至少任意计数5个视野，观察阳性染色细胞程度并准确计数。阳性染色细胞(B)的评分标准：阳性细胞数≤10%为1分；10%～50%为2分；≥50%为3分。总评分为A与B的乘积。

胃癌前病变包括腺体萎缩、肠上皮化和上皮内瘤变。癌前病变和癌变的诊断以病理诊断为金标准。

1.5统计学分析

应用SPSS 16.0统计学软件处理相关实验数据，自噬因子的表达与临床病理学特征的关系采用χ2检验。P<0.01或0.05为具有显著性差异。

2结果

2.1Beclin 1和LC3蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达情况

Beclin 1蛋白在胃癌组织中的表达率为42.5%(51/120)，在癌旁组织中的表达率为93.3%(112/120)，两者有显著性差异(χ2=21.3，P<0.05)；LC3蛋白在胃癌组织中的表达率为90.0%(108/120)，明显高于癌旁组织的表达率(29.3%，34/120) ，两者比较有显著性差异(χ2=24.8，P<0.05)。

2.2Beclin 1和LC3蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系

Beclin 1和LC3蛋白表达与胃癌分化程度和淋巴结转移密切相关，P<0.05，见表1。

表1　Beclin 1和LC3蛋白表达与胃癌

3讨论

自噬是机体由于自身代谢和某些细胞器更新的缘故，吞噬自身蛋白质或细胞器，并被溶酶体融合及降解的过程，是1种正常的、高度保守的细胞功能，与细胞增殖、凋亡以及肿瘤的发生发展息息相关。有很多研究报道表明，与细胞癌变有关的癌基因和抑癌基因可以受细胞自噬信号通路调[4-5]。消化性溃疡常常导致胃癌前病变，是胃癌发生的重要原因之一，近年来，其发病率和死亡率都居高不下，引起了社会各界人士的广泛关注[6-10]。但是自噬因子与Hp感染导致的消化性溃疡合并胃癌前病变的相关性目前并不明确，有待进一步研究。

本研究结果表明，自噬因子Beclin 1在胃癌中的表达量明显低于癌旁组织，Beclin1的低表达可能是胃癌前病变发生的分子生物学机制之一。Beclin 1主要为细胞浆内，也称为BECN1，是迄今为止在哺乳动物中发现的唯一自噬基因，是酵母自噬相关基因6(ATG6)的同系物，与多种肿瘤或癌症的发生发展息息相关。自噬性细胞死亡是一种不依赖caspase的Ⅱ型程序性细胞死亡，Beclin 1是与自噬相关的抑癌基因，是激活自噬信号通路的关键蛋白之一，可以调控调往信号通路，诱导癌细胞凋亡。Beclin 1的表达水平与肿瘤或癌症恶化程度有关，在临床上可以作为预测标志物和判断患者预后的生物学指标。Beclin 1在肿瘤中的生物学机制可能有：①肿瘤细胞受刺激后，线粒体释放大量凋亡蛋白，启动自噬来清除受损的线粒体，阻断了线粒体介导的凋亡信号通路，肿瘤细胞受到保护而存活；②Beclin 1抑制Bcl-2凋亡抑制通路，肿瘤细胞可以无限增殖；③参与自噬的Beclin 1主要位于内质网中，不同的肿瘤组织中，Beclin 1在细胞器中的分布存在很大的差异性，在某些肿瘤中，其表达量虽然高，但是不能发挥抗肿瘤效果。已有研究报道，Beclin 1在慢性肺萎缩性胃炎、胃癌前病变和胃癌的发生发展过程中的表达量及活性逐渐降低，通过自噬和凋亡通路死亡的病变细胞减少，肿瘤细胞的增殖和转移增加，同时，癌变过程中，基因组极其不稳定，癌变概率增加，进一步促进了癌症的发生。Beclin 1在胃癌组织中表达量下降，是胃癌发生的早期事件之一，因此对胃癌的患者检测Beclin 1的表达水平，可以提高胃癌的早期诊断和预后。

自噬体的形成需要多种蛋白质复合体和小分子的参与，其标志性蛋白是LC3(autophagy protein microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)，LC3-Ⅰ的C端被类泛素化酶催化后和PE(phosphatidyl ethanolamine,PE)结合转变为LC3-Ⅱ，该蛋白复合物是检测自噬现象的标志物[11]。LC3介导的自噬作用在多种胃病中都至关重要[12]，本研究显示LC3蛋白在胃癌中的表达率为90.0%(108/120)，明显高于癌旁组织的表达率(29.3%，34/120) ，两者有显著性差异(χ2=24.8，P<0.05)，结果表明LC3蛋白的高表达可能与胃癌的发生里面相关。在随后Beclin 1和LC3蛋白的表达与疾病临床病理特征的关系研究中，我们进一步发现，胃癌恶性程度高的患者中，Beclin 1表达是呈现降低的趋势，而LC3蛋白的表达是呈现逐渐上升的趋势，结果表明两者与胃癌的发生发展密切相关。

综上所述，研究自噬因子在胃癌中的作用，有助于研制新的治疗方案，使临床诊断更加准确，提高患者的早期诊断及治疗。

参考文献

[1]Zhu BS,Zhao K,Jia X,et al.Effects of damage-regulated autophagy regulator gene on the SGC7901 human gastric cancer cell line〔J〕.Oncol Lett,2014,8(2):657-662.

[2]Rasul A,Yu B,Zhong L,et al.Cytotoxic effect of evodiamine in SGC-7901 human gastric adenocarcinoma cells via simultaneous induction of apoptosis and autophagy〔J〕.Oncol Rep,2012,27(5):1481-1487.

[3]Kim MS,Jeong EG,Ahn CH,et al.Frameshift mutation of UVRAG,an autophagy-related gene,in gastric carcinomas with microsatellite instability〔J〕.Hum Pathol,2008,39(7):1059-1063.

[5]Ding Y,Zhao K,Wu Y,et al.Expression and significance of Beclin-1 in vasculogenic mimicry formation of gastric cancer〔J〕.Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2014,17(7):716-719.

[6]Ge J,Chen Z,Huang J,et al.Upregulation of autophagy-related gene-5 (ATG-5) is associated with chemoresistance in human gastric cancer〔J〕.PLoS One,2014,9(10):e110293.

[7]Hosogi S,Kusuzaki K,Inui T,et al.Cytosolic chloride ion is a key factor in lysosomal acidification and function of autophagy in human gastric cancer cell〔J〕.J Cell Mol Med,2014,18(6):1124-1133.

[8]Lee HW,Jang KS,Choi HJ,et al.Celastrol inhibits gastric cancer growth by induction of apoptosis and autophagy〔J〕.BMB Rep,2014,47(12):697-702.

[9]Li Y,Zhang J,Ma H,et al.Protective role of autophagy in matrineinduced gastric cancer cell death〔J〕.Int J Oncol,2013,42(4):1417-1426.

[10]Liu D,Gao M,Zhao S.Autophagy as a novel strategy for treatment of gastric cancer:a hypothesis〔J〕.Med Sci Monit,2013,19:794-796.

[11]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research〔J〕.Cell,2010,140(3):313-326.

[12]Halder P,Datta C,Kumar R,et al.The secreted antigen,HP0175,of Helicobacter pylori links the unfolded protein response (UPR) to autophagy in gastric epithelial cells〔J〕.Cell Microbiol,2015,17(5):714-729.

(编辑：吴小红)

Correlation Study of Expression of Autophagic Factors Beclin 1 and LC3 and Clinicopathological Features in Gastric Cancer

HUANGJunling,ZHONGTengmeng,HUANGZansong,etal.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalCollegeofNationality,Baise,533000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of autophagic factors Beclin 1 and LC3 and clinicopathological features in gastric cancer.MethodsBy immunohistochemical method,the expression of Beclin 1 and LC3 in gastric cancer tissues were detected.ResultsBeclin 1 protein expression of gastric carcinoma was 42.5% (51/120),and of adjacent tissues was 93.3% (112/120),there was significant difference (χ2=21.3,P<0.05);LC3 protein expression in gastric carcinoma was 90.0% (108/120),which was significantly higher than that of adjacent tissues (29.3%,34/120),there was significant difference (χ2=24.8,P<0.05).Beclin 1 and LC3 protein expression were closely related to the degree of differentiation and lymph node metastasis,P<0.05.ConclusionThe expression of Beclin1 and LC3 are related to carcinogenesis and development of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Beclin 1；LC3

(收稿日期2015-07-06修回日期 2015-12-21)

中图分类号：R735.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)04-0530-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.003