神经干细胞的研究进展

杨 瑞 吴晓君 贾 微 岑妍慧（广西中医药大学，广西 南宁 530001）

神经干细胞的研究进展

杨 瑞 吴晓君 贾 微 岑妍慧
（广西中医药大学，广西 南宁 530001）

神经干细胞是指能自我更新并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并足以提供大量神经组织细胞的一类细胞。自从90年代以来，人们相继从各种动物和人的中枢系统分离和培养出神经干细胞（neural stem cell,NSC）[1,2]。近年来，神经干细胞的发现和研究日益深入，为神经系统损伤和退行性变的治疗带来希望[3]。文章对神经干细胞来源、分离培养及鉴定方法和笔者的一些实际工作体会做一综述。

神经干细胞；分离；培养

1 神经干细胞的来源及其特征

分离培养神经干细胞技术的发展已经有几十年的历史，目前已有新生大鼠和新生小鼠作为神经干细胞来源的原代培养神经干细胞，胚胎发育过程中，神经干细胞分布于神经管的管壁[4]，有研究在海马和纹状体也终生存在神经干细胞[5]。近来有研究表明，皮层中亦有NSCs分布。[6]神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)属于多能干细胞，是具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能和自我更新并足以提供大量神经组织细胞的潜能的细胞[7,8]。他们受某些特定因素的调节：如神经生长因子、神经功能活动、应激反应等，特别是许多神经生长因子的调节作用对干细胞的增殖和扩增尤为重要，包括成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子以及胰岛素样生长因子-I等均可有效地促进神经干细胞的分裂和增殖，另外白血病抑制因子及其受体（leukemia inhibitory factor receptor，LIFR）介导的信号传递通路在神经干细胞的增殖过程中也起了重要的作用[9]。

2 神经干细胞分离、培养方法的比较

制备体外原代神经干细胞常用方法有：单纯机械吹打法、胰蛋白酶消化法。

2.1 非酶分离细胞法

2.1.1 单纯机械吹打法

大鼠乙醚麻醉后，首先用消毒酒精消毒其皮肤，然后迅速取出脑组织并分离两侧海马。D-Hanks液漂洗，反复切割组织，放入离心管中，吸管反复吹打至无可见组织切块，再用200目细胞筛网过滤，然后制成单细胞悬液。经细胞计数后，分装入50ml培养皿中，细胞数约为5*105/ml[10]。该方法操作简单，无需复杂以及和胰蛋白酶，经机械分离得到的单细胞活性要比酶分离得到的单细胞活性大。

2.1.2 无血清培养基培养法

最常用的是原代细胞体外培养法，神经干细胞具有持续增殖的能力，血清中含有许多诱导NSCs 分化的物质，所以目前采用无血清培养[11]。一般用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长，有研究表明，生长因子的密度会影响到神经干细胞的生长，密度过高对其生长起到抑制作用，密度过低不利于神经干细胞增殖，严重则导致悬浮的细胞贴壁分化最后衰老死亡[12]。

2.2 酶分离细胞法

2.2.1 胰蛋白酶消化法

出生24 h 内的新生SD 大鼠，用消毒头部后，断头处死，无菌条件下D-Hank’s液中打开颅腔，分离出海马，去除脑膜和血管，稍静置待组织沉入离心管底部，弃去上清，加入0.25 %胰蛋白酶1mL，37℃消化10 min 后加入4mL添加10%血清的DMEM/F12培养基终止消化，用尖端抛光的玻璃管轻轻吹打至无可见的组织块，离心、重悬即可获得神经干细胞[13]。此法用胰蛋白酶分化，操作简单，分离效果较好，价格便宜。但在实际操作中很难客观准确地把握酶作用的最佳时间，严重影响细胞活性，酶消化细胞间质的同时也消化了细胞本身。实验采用机械分离和消化分离相结合的方法，分离培养了大鼠脑神经干细胞，结果证实采取这一方案种植的细胞生长良好[11]。

2.2.2 传代悬浮培养

在原代培养的第3天能够清楚地观察到神经干细胞以漂浮的细胞团的方式生长，即形成神经球[14]。神经球在培养基中呈悬浮生长，予以更换半量培基，在培养条件不变的情况下，1周后用吸管轻柔吹打球形克隆成为小的神经球和单细胞悬液，细胞球大小基本一致，细胞的折光性增强。刘立[15]的研究结果发现接种初期有突起和生长锥的细胞在无血清培养环境下逐渐死亡，贴壁的多会生长出短突起，细胞球迅速贴壁并分化为神经元和胶质细胞，但随培养时间的延长，细胞全部呈悬浮状。

与悬浮法对比，贴壁培养法更利于进行细胞形态学的观察，获取大量同质化的细胞，对体内移植、基因操作、进行严格的克隆分析和发育学研究具有重要意义。

3 本实验培养离体神经干细胞的经验

通过以上方法反复大量的实验对比，笔者采用了饲养层条件下培养神经干细胞的稳定抑制神经干细胞的分化、促进神经干细胞的分裂增殖及保持神经干细胞的多向分化潜能的条件。现将方法叙述如下：取15～16d左右的雄性小鼠的睾丸，经0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液,培养48h后换液去除悬浮的生精细胞和间质细胞达到纯化睾丸支持细胞的目的,然后把部分生长良好的Sertoli细胞消化下来，经洗涤、固定、脱水、包埋和聚合等步骤后使用LKB-V型超薄切片机切片，铀、铅各复染10min，在日立H-500型透射电子显微镜下观察，拍照。其余生长状态良好的Sertoli细胞继续培养待其贴满瓶底表面积80%左右用0.25%胰蛋白酶消化传代，连续传至第三代待细胞长满瓶底表面积90%以上时，使用丝裂霉素C溶液处理以抑制其分裂增殖以作为饲养层。

组织化学染色进行碱性磷酸酶检测：神经干细胞碱性磷酸酶呈阳性，表明其分化程度低；目前检测巢蛋白的表达是鉴定神经干细胞最重要最常用的指标[16]。免疫组织化学染色检测神经干细胞表面特异性分子标志物-巢素蛋（Nestin）：神经干细胞Nestin染色呈阳性，胞质被染成棕黄色，表明分离出的为神经干细胞[17]，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原[18]。

4 结语

目前，神经干细胞的体外培养与分离技术迅速发展，随着研究的深入，移植治疗发生退行性变的神经细胞修复机制[19]的探讨奠定了基础，以及NSCs 移植将有可能成为治疗神经变性疾病和脑损伤的有效手段[20]。目前最理想的策略是从需要治疗的患者体内取出NSCs用于自身治疗[21]。

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The research progress of neural stem cells

The neural stem cells are to point to self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes, and enough to provide a lot of nerve tissue cells. Since the nineties, people have been isolated from various animals and human central nervous system and cultivate neural stem cells[1,2].In recent years, the discovery of neural stem cells and in-depth research, for the treatment of nervous system damage and degeneration[3].Cultivation in this paper, the sources of neural stem cells and identifying methods and some actual work experience of the author.

neural stem cells; segregation; incubation

R745

A

1008-1151(2016)11-0052-02

2016-10-11

国家自然科学基金项目（81503406）；广西高校科研课题（ZD2014068）；广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题（GZPT13-04、GZBZ16-07、GZLC16-23）。

杨瑞（1981－），男，湖北潜江人，广西中医药大学讲师，硕士。