JAM－1功能缺失对移植角膜透明度的影响

王光洁，蒋　华



JAM－1功能缺失对移植角膜透明度的影响

王光洁，蒋华＊

［摘要］目的观察2种处理方式的供体角膜在移植后的成活情况研究角膜内皮JAM－1的功能。方法首先进行免疫组织化学检测，以确定所用抗体与大鼠角膜内皮细胞的结合。然后处理供体角膜片，24片供体角膜取自12只Wistar大鼠，直径3 mm。其中右眼12片为实验组，左眼12片为对照组。用不含CaCl2和MgCl2的Hank′s液孵育以使细胞连接断开利于抗体结合；之后实验组加入抗JAM－1抗体EP1042Y，对照组加入抗体稀释液0.2 ml，作用15 min。滤纸吸干水分，转入高糖型DMEM，31.7℃培养保存3 d；最后，进行同种异体移植，24只受体大鼠分为两组，分别使用实验组和对照组供体角膜，植床直径3 mm，术后5－0丝线间断缝合上下睑缘2针。术后3、7、10 d进行裂隙灯检查，观察和评估角膜透明度和新生血管情况。结果免疫组织化学结果显示JAM－1分子存在于角膜内皮和上皮细胞，并且能与抗体EP1042Y有效结合。JAM－1功能缺失的供体角膜在各观察时间点透明度均较对照组差并且易于出现新生血管。结论作为细胞紧密连接构成成分的JAM－1，对维持供体角膜的透明和移植的成功必不可少。

［关键词］JAM－1；组织培养保存；角膜移植；紧密连接；角膜内皮细胞

［作者单位］250031山东济南，济南军区总医院眼科（王光洁，蒋华）

Influence of JAM－1 afunction on the transparency of corneal graft

WANG Guang－jie，JIANG Hua.Department of Ophthalmology，the General Hospital of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250031，China

［Abstract］ObjectiveTo approach the function of JAM－1 in corneal endothelium by observing the transparency and the development of neovessels of 2 group corneal grafts processed by different methods before penetrating corneal transplantation.Methods Immunohistochemistry methods were used to detect the presence of JAM－1 in corneal endothelium and the antibody's binding with the cell junctions of corneal endothelium.Twentyfour donor corneas were derived from 12 Wistar rats and the diameter of graft were 3mm.Twelve grafts from the right eye were arranged to experimental group，and rest 12 grafts from the left eye to control group.All corneas were incubated in Hank's solution without CaCl2and MgCl2for 10 min in order to break the cell junctions for pomoting the antidody's binding.Then corneas of the experimental group were incubated with antibody EP1042Y solution and that of control group were incubated with antibody dilution for 15 min.After ward，water content of these corneas were dried with filter paper and them were conserved in DMEM with high glucose for 3 d at 31.7℃；finally allogeneil graft penetrating cornea transplantation was carried out using the 2 group grafts described above.Twenty－four acceptor rats were divided into 2 groups equally for receiving the corneas of experimental group and control group，respectively.The recipient bed was designed to 3mm in diameter.After surgery，the margo palpebraes were sutured with 5－0 suture silk.Slit－lamp examination were processed on the day 3，7 and 10 after surgery，and the transparency and the development of neovessels were observed and evaluated.Results Immunohistochemistry showed that JAM－1 resided in the cell junction of cornea endothelium and epithelium and that the used antibody EP1042Y was effective.In cornea transplantation，the JAM－1 afunction grafts were less transparent than the control group and prone to develop neovessels.Conclusion JAM－1，as a component of cell junctions，it's function is essential for corneal grafts' transparency and even for the success of penetrating cornea transplantation surgery.

［Key words］JAM－1；Tissue culture preservation；Corneal transplantation；Corneal endothelium cell

上皮和内皮组织中，接合黏附分子－1（junctional adhesion molecule－1，JAM－1）是紧密连接有调节作用的跨膜分子。其通过N末端环的同嗜性黏附调节紧密连接的渗透性起作用。有资料显示角膜内皮细胞的紧密连接是渗透性屏障主要功能区，对维持角膜的透明有重要作用，而JAM－1分子是这一屏障的重要构成组分。为研究JAM－1分子对角膜透明度的影响，笔者采用内皮细胞JAM－1被阻断的角膜作为供体进行了同种异体角膜移植术，观察了术后不同阶段供体角膜的成活和透明度以探究JAM-1的功能。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂兔抗JAM－1单克隆抗体EP1042Y，英国Abcam公司。96孔板，24孔板，恒温孵育箱，DMEM组织培养液。手术器械与设备主要有：SOM2000A手术显微镜（苏州医疗器械总厂），3 mm直径角膜环钻，15°角膜穿刺刀，显微角膜剪，5－SA组织镊，5组织镊，显微线剪，MANI牌11－0尼龙带针眼科缝合线（日本）。

1.2使用动物Wistar大鼠40只，雌性，体重225～275 g，其中4只用于免疫组织化学检测，12只用于供体角膜片获取，24只分为两组作为移植受体。

1.3抗体效用的免疫组织化学检测Wistar大鼠4只，过量氯胺酮处死后，摘除眼球，眼球切为两部分并去除晶状体及玻璃体，4%中性甲醛固定过夜。常规进行石蜡包埋切片及检测，JAM－1单克隆抗体浓度1∶100，使用HRP标记的羊抗兔多克隆抗体作为二抗，显色剂DAB。中止反应后，苏木素复染，中性树胶封固。

1.4供体角膜片的取材和处理12只大鼠以过量盐酸氯胺酮处死。动物死亡1 h内，无菌下手术操作取鼠角膜，直径3 mm，共取角膜片共24个，其中实验组12个均为右眼，对照组12个均为左眼。放入DMEM液中暂存后两组角膜均放置于96孔板内，分别滴加不含CaCl2和MgCl2的Hank′s液0.1 ml，31℃孵育10 min以使细胞连接断开利于抗体结合，之后吸除孔内液体。实验组加入抗JAM－1抗体EP1042Y0.2 ml（浓度为1/200，约为5 g/ml），对照组加入抗体稀释液0.2 ml，作用15 min。取出角膜，滤纸吸干水份，转入装满高糖型DMEM（内加青霉素和链霉素混合液）的24孔板内。将24孔板放置于水浴箱内，温度31.7℃，培养3 d，此期间不更换培养液。保存后不进行脱水处理。

1.5手术步骤动物麻醉与术前准备：10%水合氯醛与0.02%安定的混合液0.8 ml腹腔注射，复方托品酰胺滴眼3次以散大术眼瞳孔，表麻滴酮滴眼3次进行表面麻醉。备皮后常规消毒、铺无菌巾。球后注射生理盐水0.2 ml，使眼球脱臼突出以利于手术操作。生理盐水冲洗结膜囊，吸水棉签吸干角膜表面水分，3 mm直径环钻在中央部角膜打印，深度为1/3至1/2角膜厚度，15°角膜穿刺刀倾斜15°由侧方穿入前房，前房内注入少量玻璃酸钠，略扩大穿刺口后以角膜剪沿环钻印剪下角膜，使创缘略为倾斜（取植片时与此倾斜度相同）。前房内滴入玻璃酸钠，取培养保存的角膜片放置于植床上。以11－0显微缝线进行间断缝合，共8针。创缘闭合良好后，前房注入复方林格氏液，冲洗出透明质酸钠。检查伤口闭合好，无渗液和漏水后，结膜囊涂少量典必殊眼膏，5－0丝线间断缝合上下睑缘2针，手术结束。

1.6术后处理与观察术后氧氟沙星滴眼液滴眼，4次/d。术后3d拆除眼睑缝线。在术后3、7、10d进行裂隙灯检查，观察角膜愈合情况及透明度，新生血管及并发症。以伤口闭合好，前房形成为手术成功标准。成功者进行角膜成活情况的比较。使用Quantock等［1］的评分标准记录数据，评估角膜移植片的透明度和新生血管情况。对于透明度的计分方法为：0＝角膜透明，1＝适度角膜混浊，2＝严重角膜混浊。对于新生血管的计分方法为：0＝无血管，1＝适度新生血管仅在受体角膜，2＝植片组织严重新生血管。

2　结果

2.1免疫组织化学结果免疫组织化学结果显示JAM－1分子存在于角膜内皮和上皮细胞，并且能与抗体EP1042Y有效结合。在角膜内皮层及上皮层均有明确的抗体阳性染色（图1）。

图1　JAM－1的免疫组织化学检测×70

2.2角膜移植结果每组均有10例成功，另外2例因伤口闭合不良前房未形成，排除在外。对照组在角膜移植手术完成后即明显透明（图2A），而实验组在手术完成后略显混浊（图2B）。术后3 d时对照组更加透明（图2C），而实验组混浊加重（图2D）。1周时对照组轻度混浊，仅有少量血管位于植床侧伤口边缘（图2E），实验组角膜大部分混浊（图2F），移植片周围植床已有明显血管长入。10 d时对照组透明度下降，移植片周围有血管长入，实验组完全混浊，血管长入明显。表1列出了术后0、3、7、10 d的各组角膜透明度和新生血管得分（各组的积分和）。

图2　角膜移植结果

表1　术后角膜透明度及新生血管情况得分（每组总分）

3　讨论

紧密连接是角膜基质和营养丰富的房水之间的重要生理屏障，限制旁细胞途径的离子、水和大分子的弥散。当它们的渗透性增强时允许营养成分进入无血管的基质［2］，而角膜内皮的Na/K－ATP酶则将盐转运出角膜由此带出水分［3］。二者结合的这种动态机制形成一种渗透梯度，在维持角膜透明的同时允许营养传送入基质。JAM－1是对紧密连接有调节作用的跨膜分子。JAM－1通过N末端环的同嗜性黏附对其在细胞方面的功能，特别是调节紧密连接的渗透性方面起作用［4］。但JAM－1在角膜的作用是否如此还不清楚，现有资料有限［5］。为验证JAM－1的调节作用及其功能缺失后对角膜内皮功能的影响，利用紧密连接破裂将引起角膜水肿和光学透明性丧失的特点，设计并进行了角膜移植的实验。

在进行培养保存前角膜片要与不含CaCl2和MgCl2的Hank′s液在31℃下进行孵育，目的是使细胞连接断开以利于抗体结合。此时由于细胞连接的旁细胞渗透功能受到影响，角膜组织已经开始水肿。在转入含有Ca2＋和Mg2＋的DMEM液后，实验组角膜由于加入了抗JAM－1抗体EP1042Y，细胞连接的结构和功能没有恢复而继续水肿。与实验组不同，对照组因缺Ca2＋和Mg2＋造成的旁细胞渗透性升高随环境的恢复而恢复正常，水肿得到逐渐恢复。将培养保存的时间设为3 d，一方面是为了使对照组因细胞连接受损而水肿的角膜能够恢复，实验组的角膜因抗体的存在细胞连接未恢复，继续处于水肿状态或加重，而DMEM本身使角膜发生水肿的作用也再继续。另一方面也为了防止发挥阻断作用的抗体EP1042Y因保存时间过长致抗体退化、被内吞或为内源性配基所取代，其最终结果会使细胞连接重新封闭，恢复旁细胞渗透性的调节作用。从角膜移植的结果看，抗体的作用并没有被很快消除，在两组之间形成显著差别，既实验组移植后透明度差，易发生新生血管。这说明所用的抗JAM－1单克隆抗体EP1042Y还是相当稳定的。因此在抗体阻断JAM－1后保存3 d再进行角膜移植实验的设计是合理的。

以组织培养法保存的角膜不可避免地会发生基质的水肿、透明度下降及后弹力层皱褶［6，7］，这会造成内皮细胞密度的下降。在我们先前的研究中，培养保存的角膜在单克隆抗体将JAM－1分子封闭后发生了更为严重的水肿，内皮细胞密度也进一步下降［8，9］。另一方面。角膜内皮细胞的密度低于临界数值就会使角膜水肿，因而在保存过程中要尽可能降低内皮细胞的损失，使角膜内皮细胞的密度高于临界水平。这样的角膜临床上才可以作为供体应用。由于保存过程中不可避免地会有内皮细胞的丢失［10］，且DMEM液中未加入血清、生长因子等利于内皮生长和存活的成分，不适合于长期角膜保存。为了避免因保存时间过长使内皮细胞损失过多和抗体效价降低影响实验结果，将角膜片在DMEM液中的保存时间减少至3 d。

在对大鼠角膜移植术后的观察中可以看到，JAM－1功能缺失的角膜作为供体在移植后透明度下降，与对照组相比其透明度和新生血管的积分明显较高。在移植后实验组的角膜更易于新生血管化。由于样本量较少，没有对两组的积分情况进行统计学分析，但移植后不同阶段的照片和所得到的数据足以说明EP1042Y单克隆抗体对角膜内皮细胞的功能造成了严重的损害，以致术后角膜透明度下降，并且随术后时间的延长其结果更为严重。移植实验结果显示抗体阻断JAM－1所产生效应一直持续到移植后，超过了3 d的保存时间。从效应的持续时间上看，这与Kenneth等［5］的研究中水肿可在十几小时内恢复有所不同。这可能与所用抗体不同有关，因抗体的效价及其与配体的亲和力对此是有影响的。

在角膜移植后，实验组的角膜供体在观察的各时间点均比对照组的透明度差，新生血管生长也快，最后角膜完全混浊。这说明抗JAM－1单克隆抗体的作用并没有因移植于受体动物而被削弱。这有可能是移植受体还没有来得及将受损的紧密连接完全修复移植片就已经逐渐失代偿而混浊了。而抗体的阻断作用究竟能持续多长时间还不能确定。本实验研究从角膜移植的角度证实了JAM－1是角膜内皮发挥正常功能不可缺少的跨膜分子，但其信号转导途径还不清楚。也许通过基因转染或RNA干扰能够揭示更深层次的机制，这需要以后更为深入的研究。

参考文献

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［8］王光洁，蒋华.接合黏附分子－1在大鼠角膜中的表达研究［J］.中华实验眼科杂志，2012，30（2）：204－208.

［9］王光洁，蒋华.接合黏附分子－1功能缺失对大鼠角膜内皮的影响［J］.中国实用眼科杂志，2011，29（11）：1203－1206.

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［2015－07－28收稿，2015－08－22修回］

［本文编辑：张鸿瑫］

［通讯作者］蒋华，Email：jianghua@126.com

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.01.020

［中图分类号］R779.65：R-331

［文献标志码］A