全细胞酯化曲（酶）在生物酯化液中的应用

刘义刚，周治全，周　超，张　强，李　兰（.四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都630；.成都和谐九洲酒业有限公司，四川成都638）



全细胞酯化曲（酶）在生物酯化液中的应用

刘义刚1，周治全2，周超2，张强2，李兰1
（1.四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都611130；2.成都和谐九洲酒业有限公司，四川成都611238）

摘要：全细胞酯化曲（酶）是一种脂肪酶活性很高的食品级酵母细胞菌体冻干粉，能高效快速地将黄水酒尾中的有机酸生物合成相应的芳香酯。在含1％有机酸（己酸）及酒精度为20％vol～35％vol的黄水酒尾酯化液中，加入0.3％全细胞酯化曲（酶），于25～45℃、自然pH值条件下，发酵酯化15 d，其生物酯化液中己酸乙酯含量平均达687.3mg/100 mL；用25～50 kg/甑生物酯化液串蒸酒醅，可使基酒中己酸乙酯含量增加100mg/100 mL以上，乳酸乙酯含量降低50mg/100 mL以上。生物酯化液直接蒸馏可生产己酸乙酯高达30 g/L以上的高酯调味酒，其酯香浓郁、纯正协调，醇甜净爽，可代替己酸乙酯应用于固液法白酒生产，减少白酒香料的用量，能明显消除新酒的辛辣、异味，去除酒精味和香料味，增加酒的固态感和自然感，改善酒的品质。

关键词：全细胞酯化曲（酶）；生物酯化液；串蒸；增己降乳；调味酒；白酒

在传统固态浓香型白酒发酵过程中，己酸乙酯作为浓香型白酒的主体风味物质，其含量高低直接影响曲酒的品质。己酸乙酯的形成是以己酸菌为主的多菌系和多种酶协同作用的结果，主要有两条合成途径：一是在以己酸菌为主的多菌体共同作用下，将乙醇、乙酸结合成丁酸，并进一步合成己酸，己酸与乙醇在酯化酶的作用下合成己酸乙酯；二是在发酵过程中，芽孢杆菌利用乙酸乙酯和乙醇合成丁酸乙酯，并进一步合成己酸乙酯。传统浓香型酒酿造体系中己酸乙酯生成缓慢，生产上为了增加酒香，通常会采取“回酒发酵”“夹泥发酵”“人工培养老窖泥”“双轮底”“延长发酵周期”等技术措施来提高己酸乙酯等酯香物质的含量，但是这些技术措施在实际生产中也存在诸如发酵周期长、设备利用率低、粮耗高、基酒异杂味较大、出酒率低、母糟质量较差等问题。目前浓香型白酒生产普遍存在己酸乙酯含量小于乳酸乙酯，己乳比严重失调，浓香风格不突出的现象；北方生产企业因窖泥容易老化这种现象更为突出。微生物酶法生产生物酯化液技术可以很好地弥补窖内生香不足，大幅度提高基酒中己酸乙酯含量，达到增己降乳、全面改善酒质的目的。

生物酯化液就是利用微生物技术与发酵工程技术，采用生物酶酯化法，将黄水、尾水等中的有机酸类物质及醇类物质在脂肪酶的作用下转化为以己酸乙酯为主的多种香味成分的香酯混合液。生物方法生产的酯类物质在美国联邦法规及国外文献中都定为天然香料，微生物酶法不但反应条件温和、能耗低，反应速率和转化率高，而且产品纯度高，美国联邦法规已确认为天然品[1]。微生物酶法生成的己酸乙酯等香酯与固态发酵生成的一样，属天然香料，其香味自然纯正，在白酒勾兑中具有协调的自然香，产品风味柔和、香醇自然，能增强白酒的固态感和自然感。

生物酯化液应用于传统白酒生产能大幅度提高浓香型白酒优质品率，应用于串蒸酒醅，可使基酒质量迅速提高，实现普通白酒向优质酒转化，突出浓香型白酒己酸乙酯的主体香且酒体协调；应用到白酒勾兑中，采用生物酯化生成的高酯酒完全能代替化工合成香料，从而解决外加香不自然协调、存在的“浮香”的质量问题。

生产高质量的酯化液除了要因地制宜制定科学合理的酯化液配方外，关键是要有能高效地将有机酸转化为生物酯的高活性脂肪酶即所谓的酯化曲（酶）。当前白酒厂在生产酯化液时使用的酯化曲（酶）多为粗酶制剂（如大曲、根霉、红曲霉等），这些粗酶制剂存在不足之处，如用曲量大（5％～10％）、效果不明显、活性不稳定、酶活力较低、酯化时间较长，香味物质含量低，风味不够协调、有异杂味等。本方案创新使用的酯化曲是一种新型高效白酒专用酯化曲（酶）即全细胞酯化曲（酶），全细胞酯化曲（酶）是一种活性很高的南极假丝酵母脂肪酶B (CALB)，它是一种新型的全细胞脂肪酶制剂，其生物合成工艺具有低能耗、无污染、转化率高、选择性专一等优点，没有界面活性，有极强的立体选择性，且具有广谱的底物接受性，对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性，在酯化、水解、转酯以及其他类型反应中都表现出比其他脂肪酶更为出色的催化活性。具有用量小（0.2％～0.3％）、反应时间短、产率高、操作稳定性好等特点。用它制备生物酯化液，能克服粗酶制剂诸多不足。该种脂肪酶在白酒行业内尚未全面推广应用，只是在实验室下进行了清香白酒丢糟处理，将丢糟中残存的有机酸（乙酸和乳酸）转化为相应酯的试验，取得了一定的效果[2]。利用全细胞酯化曲（酶）生物酯化生产酯化液的方法尚属首创，其生产应用方案还未见相关报道。目前该种酯化曲（酶）已开始在酿酒企业应用，达到了预期目的，取得了令人满意的效果，制备的酯化液质量高，生成的生物酯香味纯正自然，与传统工艺配套使用，酒质大幅提高，增己降乳效果十分显著。为了进一步研究和创新应用全细胞酯化曲（酶），本文抛砖引玉，不当之处，请同行指正。

1　全细胞酯化曲（酶）特性

全细胞酯化曲（酶）是以表面展示有南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母菌为出发菌株，经液体深层培养，真空冷冻干燥制成的全细胞脂肪酶制剂。全细胞酯化曲（酶）为微黄色粉末，具有轻微的酵母固有的清香，无异味，易溶于水。它是一种脂肪酶活性很高的酵母细胞菌体冻干粉，是一种新型的酿酒酵母全细胞脂肪酶制剂。在众多脂肪酶中，南极假丝酵母脂肪酶B的用途最为广泛，它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。近几年的研究表明，在酯化、水解、转酯以及其他类型反应中都表现出比其他脂肪酶更为出色的催化活性。尤其是在非水相催化中，具有反应时间短、产率高、操作稳定性好的特点。该全细胞酯化曲（酶）具有多项合成功能，能受控制同时合成生物酯如己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯类物质。酿酒酵母细胞为FDA认证的安全微生物，已广泛应用于食品工业。展示有南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母全细胞既可直接作为食品或饲料添加剂，还可全细胞催化生产食品添加剂、医药化工原料等[3]。用其生产酯化液制备己酸乙酯等生物香酯，完全符合绿色食品的要求。

全细胞酯化曲（酶）在非水相中催化己酸和乙醇酯化合成己酸乙酯的能力很强，反应物己酸与乙醇的摩尔比为1∶1.25，己酸乙酯的产率高达98.0％。其最适温度为40～45℃，适宜的酯化温度为25～50℃；最适pH值7.5～8.0，用pH值为3.0～7.5之间的缓冲液处理24 h (20℃)，其稳定性随pH值的增加而增加[4]。具有活性高、用量少（0.2％～0.3％）、转化率高、酯化反应较快、生成的酯类物质香味自然纯正柔和等特性。

2　生物酯化液生产方案

2.1生物酯化液制备方法

生物酯化液就是利用微生物技术与发酵工程技术，将浓香型白酒生产过程中产生的黄水、酒尾等副产物中的有机酸和乙醇等成分通过生物酶转化为富含以己酸乙酯为主要成分的酯类等白酒香味成分的混合液。将生物酯化液与传统工艺相结合，采用串蒸等技术措施大幅提高基酒中己酸乙酯含量，达到“增己降乳”全面提升酒质的目的。

2.2生物酯化液制备工艺流程

黄水、酒尾等→混合→加全细胞酯化曲（酶）→搅拌均匀→25～45℃下发酵酯化15 d→成熟生物酯化液→备用。

2.3生物酯化液组成

生物酯化液原材料主要由黄水、酒尾和全细胞酯化曲（酶）组成，为了丰富生物酯化液的微量成分，可根据生产实际情况添加适量母糟和大曲等酿酒材料。酯化液组成一般是黄水∶酒尾为（10～40）∶（90～60），要求生物酯化液酒精度为20％vol～35％vol，己酸含量为1％，全细胞酯化曲（酶）用量为0.3％。

本方案经优选并结合生产实际最终确定大生产酯化液的配方如下：优质黄水为20％、酒尾80％（发酵正常的优质酒尾，要求酒精度为30％vol左右，可用丢糟酒或食用酒精等调节使酯化液酒精度达25％vol左右），在此基础上加入0.3％全细胞酯化曲（酶）、1％有机酸(己酸)；另可加入1％的优质母糟和1％优质大曲粉。

2.3.1黄水常规成分分析和色谱分析

通过对不同窖龄、不同发酵期、不同季节黄水的成分分析，得知黄水的分析结果数据各不相同；黄水的成分比较复杂，窖池、母糟及其发酵状况、大曲质量、操作工艺等情况不同，其成分种类和数量差异较大。其黄水的成分含量范围见表1、表2。

表1　黄水常规成分分析结果

表2　黄水中主要微量成分分析结果　(mg/100mL)

黄水是浓香型白酒酿造过程中的副产物，为深棕色胶状透明液体，外观黏稠，悬丝长，味酸涩，含有丰富的醇类、酸类、醛类、酯类等呈香呈味物质，以及经长期驯化的梭状芽孢杆菌等有益微生物。黄水中还含有丰富的有机酸尤其是乳酸、乙酸、己酸、丁酸含量最丰富，是生产酯化液的最佳材料。因黄水中乳酸含量很高，故在酯化液生产中用量不宜过大，以不超过50％为宜。

2.3.2酒尾主要成分分析

酒尾是酿酒蒸馏过程中取完酒以后的附属产品，酒度一般在40％vol以下，色泽微浑浊、表面有微黄色油珠，闻香带酸香、香正、味酸、微涩。酒尾中含有较多的高沸点香味物质，特别是有机酸含量较多，是生成酯的前体物质。其主要成分见表3。

2.4生物酯化液酯化设备及条件

表3　酒尾主要成分分析　(mg/100 mL)

生物酯化液酯化设备可因地制宜选用,量小时可用500～1000 L的陶坛,量大时可用10 m3以上的不锈钢酒罐。生物酯化液生产因需要一定的温度酯化，生产酯化液最好选在夏季气温高时进行，供全年使用。若常年生产需采取保温措施。

本方案选择的酯化设备和条件如下：

酯化设备：30 m3不锈钢酯化罐（内置蒸汽盘管）2个，轮换使用。

酯化条件：pH值自然；温度25～45℃；时间15 d。

2.5生物酯化液生产操作规程

(1)将黄水酒尾按比例泵入酯化罐，通气混合均匀,使其混合后酒精度达25％vol左右，然后加入1％的发酵己酸，充分搅拌均匀。

(2)将0.3％的全细胞酯化曲（酶）用少量黄水酒尾混合液充分溶解后加入酯化液中，搅匀。

(3)将母糟和大曲粉按比例加入酯化液中，充分搅拌均匀，于25～45℃下密封发酵酯化；每天定期搅拌1次，保温酯化15 d左右即成熟，备用。

2.6生物酯化液理化指标分析

成熟的生物酯化液具有浓郁的以己酸乙酯为主的复合香气，酯香自然，无黄水和酒尾味。取样前先通气搅拌均匀，然后取发酵成熟的酯化液100 mL，将试样倒入500 mL蒸馏烧瓶中，量取50 mL蒸馏水充分洗涤后倒入酯化液的三角瓶，将洗液一并倒入烧瓶中蒸馏，取蒸馏液100 mL，用气相色谱测定四大酯（己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯）。6批次生物酯化液生产实际分析结果见表4。

表4　生物酯化液主要成分分析　(mg/100mL)

从表4可以看出，第6批次的酯化效果最好，酯化液中己酸乙酯最高为772.5mg/100 mL；第4批次发酵酯化液酯化效果最差，其己酸乙酯为398.1mg/100 mL，这主要是因为锅炉停汽而保温效果不好，酯化温度（＜25℃）较低所致。其他各批次发酵酯化效果符合生产要求，酯化液中己酸乙酯含量均大于622.0mg/100 mL，平均达687.3mg/100 mL（除第4批次外）。此外，酯化液中还含有少量的乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯等酯类物质。由此表明，全细胞酯化曲（酶）具有很强的酯化力特别是己酸乙酯生成能力，完全符合生产要求。

3　生物酯化液在浓香型白酒生产中的应用方案

3.1酒醅串蒸

增己降乳，全面提升基酒等级。

3.1.1粮糟串蒸

将不同数量生物酯化液倒入底锅用发酵70 d的粮糟串蒸得到的基酒,与直接用发酵70 d的粮糟蒸馏所得到的基酒进行理化数据分析比较和感官鉴评，结果见表5、表6。

表5　不同加量生物酯化液粮糟串蒸基酒与对照基酒主要成分分析结果　(mg/100 mL)

表6　不同生物酯化液加量粮糟串蒸基酒与对照基酒感官尝评结果

从表5可以看出，对照样基酒四大酯含量为乳酸乙酯＞己酸乙酯＞乙酸乙酯＞丁酸乙酯，四大酯比例不协调，特别是己酸乙酯与乳酸乙酯之比小于1，使对照酒的浓香典型性不突出。随着生物酯化液串蒸量的增加，基酒中己酸乙酯显著增加，己乳比大于1，窖香突出，典型性增强；当酯化液串蒸量达100 kg/甑时，基酒中的己酸乙酯高达905.7mg/100 mL，可作高酯调味酒。适量加入酯化液串蒸后，四大酯比例协调，特别是己酸乙酯与乳酸乙酯之比大于1，浓香型酒主体香突出，这证明了加入酯化液串蒸后可以较大幅度地增加己酸乙酯含量，总酸总酯都有增加，白酒中各种微量成分更加协调，提高了酒的质量和产量。同时加入酯化液串蒸后能明显降低乳酸乙酯的含量，达到增己降乳的目的。

从表6可以看出，加入酯化液串蒸后，所产基酒窖香浓郁，酯香突出，酒体丰满，风格典型，醇厚感增加，后味悠长，新酒气明显减弱，基酒质量全面提高。

3.1.2丢糟串蒸

将生物酯化液倒入底锅用发酵40 d的丢糟串蒸得到的串蒸酒，与直接用发酵40 d的丢糟蒸馏所得到的丢糟酒进行理化数据分析比较和感官鉴评，结果见表7、表8。

表7　丢糟串蒸酒与对照丢糟酒主要成分分析结果　(mg/100mL)

表8　丢糟串蒸酒与对照丢糟酒感官尝评结果

从表7、表8可知，丢糟加生物酯化液串蒸后，酒质明显改善，己乳比大于1，其四大酯比例更加协调，浓香风格突出，通过生物技术完全可以使丢糟酒达到合格酒要求。

3.2直接蒸馏生产高酯调味酒

将生物酯化液加入釜式蒸馏器或酒尾提酒器，用水蒸汽直接蒸馏，摘取酒精度为65％vol以上蒸馏液，其主要成分及品评结果见表9。

表9　蒸馏液(高酯调味酒)主要成分分析结果　(g/L)

由表9所知，此蒸馏液含浓香型白酒的主体香味物质己酸乙酯含量高达35.2 g/L，成为酯化液的主体香味成分，并含有适量的其他酯类物质，其酯香特别浓郁、纯正协调，醇甜净爽，是很好的高酯调味酒，可以协调四大酯比例，使酒体闻香更好，口感浓香突出，后味更醇和甜净，酒质明显改善；代替己酸乙酯应用于固液法白酒生产，能明显消除新酒和酒精中的辛、辣、异味，并有迅速催陈的作用，可以缩短新酒存放期，增加白酒固态感和自然感。

3.3其他应用

生物酯化液除了含较高的酯类物质外，还含有较丰富的有益功能菌和酯化酶。企业可根据实际生产情况加以应用，如直接回窖发酵，也可用于养窖或人工老窖生产等。

4　结语

4.1通过生产应用表明，全细胞酯化曲（酶）是一种脂肪酶活性高的食品级酵母细胞菌体冻干粉，能高效快速地将黄水酒尾中的有机酸生物合成相应的芳香酯。作为新型高效白酒专用酯化曲（酶），它具有性能稳定、酯化条件温和、操作简便、酯化率高、用曲量少（0.2％～0.3％）、酯化反应较快、生成的酯类物质酯香纯正、香味自然、增己降乳效果明显等特性。在含1％有机酸（己酸）及酒精度为20％vol～35％vol的黄水酒尾酯化液中，加入0.3％全细胞酯化曲（酶），于25～45℃、自然pH值条件下，发酵酯化15 d，酯化液中己酸乙酯含量均大于622.0mg/100 mL，平均达687.3mg/100 mL。香气是以己酸乙酯为主的馥郁酯香，且香味纯正自然，无异味。由此表明，全细胞酯化曲（酶）具有很强的酯化力特别是己酸乙酯生成能力，完全适应生产需要。

4.2生物酯化液串蒸，效果显著。每甑可根据母糟质量加入适量的酯化液串蒸，能明显增加己酸乙酯含量，降低乳酸乙酯含量，提高基酒质量1～2个等级。可改变现在酿酒生产中乳酯高己酯低的现象，增己降乳效果十分明显，且各香味成分协调。若用25～50 kg/甑生物酯化液串蒸酒醅，可使基酒中己酸乙酯增加100mg/100 mL以上，乳酸乙酯降低50mg/100 mL以上，己乳比大于1，四大酯比例更加协调合理，酒质全面提升1～2个等级以上，且出酒率也有一定增加。生物酯化液串蒸量越多，其基酒中己酸乙酯含量越高，量质摘酒能摘取更多的优质调味酒。

4.3生物酯化液直接蒸馏可生产己酸乙酯高达30 g/L以上的高酯调味酒，其酯香特别浓郁、纯正协调，醇甜净爽，可以代替己酸乙酯应用于固液法白酒生产，减少白酒香料的用量，能明显消除新酒的辛辣、异味，去除酒精味和香料味，增加酒的固态感和自然感，改善酒的品质。

4.4利用现代生物技术生产生物酯化液具有生产工艺简单，生产设备要求不高，操作方便，简单易行等特点。量小时可用0.5～1 t的陶坛生产，量大时可用10～100 t以上的不锈钢大罐生产酯化液。生产酯化液最好选择气温最高的夏季进行，可供全年使用；若要全年生产酯化液，则酯化设备应有保温设施。

4.5生物酯化液的生产应用要与传统酿酒工艺有机结合，配套使用。生物酯化液的生产：一是要根据企业实际情况制定科学合理的酯化液配方，在保证一定底物浓度下，要充分利用生产正常的黄水、酒尾、酒糟（香醅）、己酸菌液（发酵有机酸）、中高温大曲及优质老窖泥等作为酯化液的原料，以丰富酯化液的微量成分；二是要选取用量小、酯化率高、生香物质香味纯正自然的高转化率酯化曲（酶）；三是要加强保温措施，保障酯化正常进行。酯化液应用可根据本厂实际采取串蒸、直接蒸馏或入窖再发酵等方式进行，充分利用酯化液中大量的香酯特别是己酸乙酯来提高基酒的含量，达到全面改善和提高酒质的目的。

4.6全细胞酯化曲（酶）是高科技生物酶制剂，比传统酯化曲具有更高的催化活性和更少的用量（不足红曲酯化曲用量的10％），是当前制备生物酯化液的最佳催化剂。酯化酶在生物酯化液的生产及应用，是现代生物工程技术改造传统工艺，推动企业创新发展，促进白酒产业技术升级的一项重要生物工程技术，不仅能充分弥补窖内生香的不足，大幅提高基酒中己酸乙酯及总酯含量，达到增己降乳、全面提升酒质的目的，而且能最大限度利用黄水和酒尾中的有益成分，提高资源综合利用率，实现清洁生产。

参考文献：

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[2]潘志友，韩双艳，林影，等.南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母表面展示及其催化己酸乙酯的合成[J].生物工程学报,2008,24(4)：674-676.

[3]黄登峰，潘志友，林影，等.酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究[J].现化食品科技,2008(7)：630.

The Application of Whole-Cell Esterifying Enzyme in Bio-Esterifying Liquid

LIU Yigang1,ZHOU Zhiquan2,ZHOU Chao2,ZHANG Qiang2and LI Lan1
(1.Sichuan Food Fermentation Industry Research &Design Institute,Chengdu,Sichuan 611130;2.Chengdu Hexie Jiuzhou Distillery Co.Ltd.,Chengdu,Sichuan 611238,China)

Abstract:Whole-cell esterifying enzyme is food-grade yeast cell lyophilized powder with high lipase activity,which can effectively turn organic acids in yellow water into aromatic esters.By adding 0.3% of whole-cell esterifying enzyme into the yellow-water-esterifying liquid (20％vol～35％vol) that contained 1% of caproic acid,and fermenting for 15 days under conditions of 25～45℃and natural pH value,the content of ethyl caproate in the bio-esterifying liquid could reach 687.3mg/100 mL.By using 25～50 kg/steamer bio-esterifying liquid for cross-steaming with fermented grains,the content of ethyl caproate in the base liquor would increase over 100mg/100 mL,while the content of ethyl lactate would decrease over 50mg/100 mL.Distilling the bio-esterifying liquid directly,we could get flavoring liquor with ethyl caproate content up to 30 g/L,which had strong ester aroma,tasted pure,harmonious,rich and clean,and could replace ethyl caproate in the production of Baijiu by solid-liquid fermentation.Such method could reduce the consumption of flavorings,eliminate the spicy,bad,alcoholic or additive flavor in the newly produced liquor,make the liquor taste more natural,and improve the quality of the liquor.(Trans.by HUANG Xiaoli)

Key words:whole-cell esterifying enzyme;bio-esterifying liquid;cross-steaming;caproic acid-increasing and lactic acid-decreasing;flavoring liquor;Baijiu

作者简介：刘义刚（1964-），男，重庆人，大专，高级工程师，副总经理，发表科研论文30余篇。

收稿日期：2016-01-20

中图分类号：TS261.1；TS262.3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）02-0072-05

DOI：10.13746/j.njkj.2016024

优先数字出版时间：2016-01-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160125.1114.002.html。