糖皮质激素诱导的蛋白激酶在缺血大鼠海马神经元细胞中的保护作用

张　玮　李树清

(昆明医科大学第一附属医院急诊科，云南　昆明　650032)



糖皮质激素诱导的蛋白激酶在缺血大鼠海马神经元细胞中的保护作用

张玮李树清1

(昆明医科大学第一附属医院急诊科，云南昆明650032)

〔摘要〕目的探讨糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)在大鼠海马神经元细胞中缺血再灌注中的保护作用。方法将海马神经元细胞根据氧糖剥夺(脑缺血)诱导时间不同分为正常海马神经元细胞组，氧糖剥夺诱导120 min组、氧糖剥夺诱导120 min后正常恢复10 min组、氧糖剥夺诱导120 min后正常恢复30 min组和氧糖剥夺诱导120 min后正常恢复60 min组。采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术对样品进行检测，区分实验样本中正常、坏死、凋亡细胞。结果随着氧糖剥夺(脑缺血)时间的延长而神经元细胞凋亡的数量呈现不断增加的趋势；而随着氧糖剥夺(脑缺血)时间的延长，SGK1在蛋白水平的表达出现不断下降的趋势；和对照组相比其神经元细胞凋亡的数量明显减少；SGK1蛋白的过表达受到抑制。结论SGK1可以有效减少氧糖剥夺SD大鼠海马神经元细胞的凋亡，而SGK1调控神经元细胞凋亡的模式是通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路来介导。

〔关键词〕糖皮质激素诱导的蛋白激酶1；神经元细胞；缺血再灌注

研究发现，缺血再灌注损伤是对组织造成损伤的主要因素，即再次恢复血液供应，缺血组织灌注时造成的微血管和实质器官的损伤〔1～3〕，本研究旨在探讨糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(SGK1)在大脑缺血再灌注过程中可能的保护机制。

1资料和方法

1.1样本来源本研究用细胞为培养后的1日龄SD大鼠神经元细胞。对SD大鼠采用椎脱臼处死法处死，用75%酒精浸泡消毒3～5 min；取出海马神经元细胞进行培养。

1.2试验方法

1.2.1大鼠海马神经元细胞的额分离及培养选用1日龄SD大鼠2只。通过对大鼠进行消毒后处死，获取了SD大鼠的海马细胞，并进行了体外培养。

1.2.2已分离培养的SD大鼠海马神经元细胞的免疫荧光鉴定采用海马神经元特异性抗微管相关蛋白2(MAP2)抗体免疫荧光来显示分离和培养的结果，在显微镜下计数，记录每个视野中染色阳性的细胞占所有细胞的比值，超过95%的为阳性。

1.2.3通过氧糖剥夺诱导海马神经元凋亡将海马神经元细胞根据氧糖剥夺诱导时间不同分为正常海马神经元细胞组，氧糖剥夺诱导120 min组、氧糖剥夺诱导120 min后正常恢复10 min组、氧糖剥夺诱导120 min后正常恢复30 min组和氧糖剥夺诱导120 min后正常恢复60 min组。采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术对样品进行检测，区分实验样本中正常、坏死、凋亡细胞。

1.2.4Western印迹技术检测上述步骤中各种细胞的SGK1表达实验对样本进行总蛋白提取与定量，根据SGK1的mRNA序列(序列号：NM_001193568.1)设计了该基因的全基因引物，获得目的基因SGK1模板，构建质粒载体，并进行过表达效率检测。

1.3统计学方法采用SPSS16.0进行分析。

2结果

2.1氧糖剥夺诱导海马神经元凋亡及SGK1表达情况NC代表未经任何处理的培养过的SD大鼠海马神经元细胞、OGD表示对培养过的SD大鼠海马神经元细胞进行了120 min的氧糖剥夺，而10 min组、30 min组和60 min组则表示培养过的SD大鼠海马神经元细胞在进行了120 min的氧糖剥夺之后分别进行了10 min、30 min和60 min的氧糖正常供给。各组凋亡情况及SGK1表达见表1，图1。

2.2SGK1基因蛋白水平的过表达能阻止氧糖剥夺120 min的培养过的SD大鼠海马神经元细胞的凋亡与NC组比较，转染SGK1过表达载体的细胞内，可以SGK1导致mRNA的表达增加约5倍；在转染了SGK1过表达病毒载体的细胞中，SGK1基因在蛋白水平的表达约超过未处理组的2.5倍。海马神经元分别转染了空载体或编码SGK1基因的表达载体；在转染24 h后，SGK1在基因水平和蛋白质水平的变化情况和NC相比具有显著性差异。海马神经元分别转染了空载体或编码SGK1基因的表达载体24 h，然后进行120 min的氧糖剥夺，然后使之恢复60 min；运用流式细胞仪分析用膜联蛋白V/PI双染色法来检测细胞凋亡情况。通过免疫印迹实验检测SGK1和活化的金属基质蛋白酶(caspase)-3蛋白水平差异情况。见表2，表3，图2。

表1　各组大鼠海马神经元细胞凋亡及SGK1蛋白表达

图1　SD大鼠SGK1表达情况

观察指标NC组Voctor组SGK1组F值P值基因水平1.00±0.131.02±0.122.71±0.6324.311<0.001蛋白水平1.05±0.101.03±0.115.43±1.3631.005<0.001

表3　SGK1过表达可保护神经元细胞在

3讨论

缺血性脑血管病是目前导致人类，尤其是老年人致死和致残率最高的疾病之一。对于缺血性脑血管病当前最主要的治疗原则是对缺血区域进行血液灌注〔4〕；然而近期发现对缺血性脑血管疾病的缺血再灌注非但没有使组织功能恢复，反而会导致缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重，这种现象即缺血再灌注损伤〔5〕，在各种模式生物〔6〕和人类〔7〕研究中都得到了一致的结果。

本研究结果发现，对体外培养的SD大鼠海马神经元细胞进行氧糖剥夺可导致SD海马神经元细胞凋亡数量的增加，而之后随着再恢复氧糖供应时间的增加，神经元细胞凋亡的数据则呈现进一步加剧的趋势。而SGK1的过表达则可以抑制SD大鼠海马神经元细胞因氧糖剥夺导致的细胞凋亡的趋势。

另外本结果显示，SGK1的过表达能显著降低因氧糖剥夺导致的SD大鼠海马神经元细胞凋亡的数量，这一结果得到了荧光辅助细胞筛选分析的支持，提示Akt和GSK-β可对经受缺血再灌注海马神经元细胞能起到保护作用。

4参考文献

1Fields JD，Khatri P，Nesbit GM，etal.Meta-analysis of randomized intra-arterial thrombolytic trials for the treatment of acute stroke due to middle cerebral artery occlusion〔J〕.J Neurointerv Surg，2011;3(2)：151-5.

2Lang F，Böhmer C，Palmada M，etal.(Patho)physiological significance of the serum-and glucocorticoid-inducible kinase isoforms〔J〕.Physiol Rev，2006;86(4)：1151-78.

3熊涛，屈艺，母得志.AKT-GSK3信号通路与缺血缺氧性脑损伤〔J〕.医学综述，2010;16(23)：3521-4.

4Dirksen MT，Laarman GJ，Simoons ML,etal.Reperfusion injury in humans：a review of clinical trials on reperfusion injury inhibitory strategies〔J〕.Cardiovasc Res，2007;74(3)：343-55.

5Choi DW.Ischemia-induced neuronal apoptosis〔J〕.Curr Opin Neurobiol，1996;6(5)：667-72.

6Hokari M，Kuroda S，Kinugawa S，etal.Overexpression of mitochondrial transcription factor A(TFAM)ameliorates delayed neuronal death due to transient forebrain ischemia in mice〔J〕.Neuropathology，2010;30(4)：401-7.

7Itoh T，Satou T，Nishida S，etal.Edaravone protects against apoptotic neuronal cell death and improves cerebral function after traumatic brain injury in rats〔J〕.Neurochem Res，2010;35(2)：348-55.

〔2015-11-03修回〕

(编辑袁左鸣)

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〔中图分类号〕R74

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)06-1300-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.009

通讯作者：李树清(1953-)，男，博士生导师，教授，主要从事脑缺血与脑保护的研究。

基金项目：云南省科技厅应用基础研究基金(No.2013FB131)；云南省教育厅科研基金(No.2013Y281)

1昆明医科大学基础医学院病理生理教研室

第一作者：张玮(1975-)，男，博士，副主任医师，主要从事急诊医学方面的研究。