连翘叶提取工艺优选

王亚恒，姚宁，王龙，石巧巧，白吉庆，王小平

(陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046)



连翘叶提取工艺优选

王亚恒，姚宁，王龙，石巧巧，白吉庆，王小平

(陕西中医药大学 药学院，陕西 咸阳 712046)

目的 优化连翘叶提取工艺，为制备连翘叶速溶茶奠定基础。方法 采用正交试验，考察乙醇体积分数、料液比、回流时间和回流次数4个因素对连翘苷、连翘酯苷A、芦丁的质量分数和出膏率的影响。结果 优选的工艺为：6倍量体积分数50%乙醇，提取2次，每次0.5 h；其中回流次数对连翘叶提取工艺的影响具有统计学意义(P<0.05)。结论 优化后的提取工艺稳定可靠，可为进一步制备连翘叶速溶茶提供参考。

连翘叶； 提取工艺； 正交试验； 连翘苷； 连翘酯苷A； 芦丁； 出膏率

连翘叶为木犀科植物连翘Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的干燥叶，夏、秋季采集，鲜用或晒干，具有清热解毒之功效[1]。连翘叶与连翘果实化学成分基本相同[2]，且有些成分的质量分数远高于连翘果实[3]，在我国河北、陕西和河南等地常作为保健茶使用，被认为具有良好的保健价值[4]。连翘叶资源丰富，具有抑菌、抗氧化、清除自由基、提高免疫功能、降压和抗衰老等多种生物活性[5-8]，具有广阔的开发前景。本文以芦丁、连翘酯苷A、连翘苷的质量分数和出膏率作为评价指标，采用正交试验优选连翘叶提取工艺，为连翘叶速溶茶的开发奠定基础。

1 仪器与材料

BT125D型多量程电子分析天平(赛多利斯股份有限公司，d=0.1 mg，0.01 mg)；DZF-6050B型真空干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)；戴安UltiMate3000全自动高效液相色谱仪(二极管阵列检测器)；101-2型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器设备有限公司)。

连翘叶采摘于陕西省洛南市，经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定为木犀科植物连翘Forsythiasuspense(Thunb.) Vahl的叶。连翘苷对照品(110821-200711)、连翘酯苷A对照品(111810-201001)、芦丁对照品(100080-200707)均由中国生物制品检定研究院提供。乙腈为色谱纯，水为纯化水，乙醇、冰醋酸等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 连翘苷、芦丁和连翘酯苷A质量分数的测定[9]

2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取连翘苷对照品、芦丁对照品和连翘酯苷A对照品0.79、1.06、1.91 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品粗粉5.0 g，精密称定，分别加入精密称定的相应溶剂，进行回流提取，提取液合并减压浓缩后，置25 mL容量瓶中，加相应溶剂定容至刻度，摇匀，精密吸取1 mL置100 mL的量瓶中,加相应溶剂定容至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件[9]以Hypersil GOLD C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，乙腈-质量分数0.4%冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱(0～8 min，10%～15%乙腈；8～18 min，15%～22%乙腈；18～25 min，22%～40%乙腈；25～30 min，40%～95%乙腈；30～35 min，95%～95%乙腈)；流速为1.0 mL/min，检测波长为277 nm，柱温为25 ℃。理论塔板数按连翘酯苷A计算应不低于5 000。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取上述混合对照品溶液1、2、4、5、7、8、10 μL，注入液相色谱仪分析，每个体积进样2 次，记录各对照品的峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量(μg)为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程：Y芦丁=11.38X-0.019 1，r=0.999 9；Y连翘酯苷A=8.919 1X-0.018 9，r=0.999 9；Y连翘苷=6.949 3X+0.037，r=0.999 9；结果表明芦丁、连翘酯苷A和在连翘苷分别在0.106～1.06、0.191～1.91、0.079～0.79 μg范围内线性关系良好。

2.1.5 方法学考察 精密度试验3种成分峰面积的RSD值分别为1.28%、1.33%、1.24%，表明仪器精密度良好；稳定性试验3种成分峰面积的RSD值分别为1.65%、0.93%、0.88%，表明供试品溶液中待测成分在17 h内基本稳定；重复性试验3种成分质量分数的RSD值分别为2.92%、2.12%、2.99%，表明方法重复性良好；加样回收试验3种成分的平均回收率分别为99.45%、99.47%、98.87%，RSD值分别为2.26%、0.87%、1.23%；均符合方法学考察要求。

2.2 正交试验的设计方法与结果

考察了乙醇体积分数(A)、回流时间(B)、回流次数(C)和料液比(D)4个因素,每个因素3个水平。因素水平表见表1。

表1 优化连翘叶提取工艺的因素水平表

Table 1 Factors and levels of extraction technology ofForsythiasuspensaleaves

水平因素A乙醇体积分数/%B回流时间/hC回流次数D料液比/(g∶mL)1300.511∶62401.021∶83501.531∶10

以芦丁、连翘酯苷A、连翘苷的质量分数和出膏率为评价指标，取连翘叶粗粉5.0 g，精密称定，按L9(34)正交试验表安排试验，并进行极差和方差分析，结果见表2～表4。

因单体成分连翘酯苷A的质量分数和出膏率的方差分析显示各因素的影响均无统计学意义，因此只列出具有统计学意义的单体成分芦丁和连翘苷的质量分数的方差分析结果，见表3～表4。由表3可见，影响芦丁提取的因素主次顺序为回流次数>料液比>乙醇体积分数>回流时间，其中回流次数对芦丁提取的影响有统计学意义；由表4可见，影响连翘苷提取的因素主次顺序为回流次数>乙醇体积分数>料液比>回流时间，其中回流次数和乙醇体积分数对连翘苷的提取有统计学意义。综合考虑，确定较佳提取工艺为A3B1C2D1，即用6倍量的体积分数50%乙醇，回流2次，每次0.5 h。

2.3 验证性试验

取样品粗粉 5.0 g(6份)，精密称定，按照最佳工艺A3B1C2D1进行回流提取，依法测定指标成分的质量分数，芦丁、连翘酯苷A、连翘苷峰面积RSD值为1.68%、1.85%、1.53%，质量分数平均值分别为11.12、17.69、9.93 mg/g，平均出膏率为30.76%。表明该工艺结果稳定，重复性好。

表2 优化连翘叶提取工艺的正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test of extraction technology of Forsythia suspensa leaves

表3 芦丁质量分数的方差分析结果Table 3 ANOVA results of rutin

表4 连翘苷质量分数的方差分析结果Table 4 ANOVA results of phillyrin

3 讨论

本文对连翘叶提取工艺进行探究，优选出较佳提取工艺，为制备连翘叶速溶茶奠定基础。现代研究表明芦丁具有抑菌等生物活性[10]；连翘苷、连翘酯苷具有抑菌、抗感染、抗氧化、清除自由基和抗衰老等活性[11-12]，与连翘叶的功能主治一致，是连翘叶的主要有效成分，故选定上述3种成分和出膏率作为评价指标，对提取工艺进行多指标综合评定。

本文以多个活性成分和出膏率为指标，优化提取工艺，兼顾各指标的协同效应，较全面反映提取物有效成分的信息，符合中药有效成分多样性的特点。优化的提取工艺结果稳定可靠，为连翘叶速溶茶的制备奠定了基础。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草第十六卷[M].上海:上海科技出版社,1999：157-159.

[2] 陈玲,李晓,李倩,等.连翘属植物化学成分的研究进展[J].现代药物与临床,2013,28(3):441-445.

[3] 张杲,李发荣,段飞,等.不同采收期连翘叶中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量测定[J].天然产物研究与开发,2005,17(6):790-793.

[4] 张杲,王喆之,李法荣.连翘(Forsythiasuspense)叶药用价值及药用活性组分的初步研究[D].西安:陕西师范大学,2006.

[5] 薛愧玲,袁王俊.连翘叶的药理研究综述[J].时珍国医国药,2009,20(5):1149-1150.

[6] 段飞,张双民,杨建雄,等.连翘叶提取物抑菌作用的研究[J].西北药学杂志,2005,20(2):66-67.

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[8] 王燕,田粟.连翘不同部位和不同生长时期连翘叶抗氧化作用的比较与评价[D].石家庄:河北医科大学,2011.

[9] 王芳,白吉庆,王小平,等.阴坡、阳坡连翘及连翘叶中不同成分含量的比较[J].中国现代中药,2016,18(2):185-202.

[10] 王亚男.芦丁对金黄色葡萄球菌Sortase A抑制作用的初步研究[D].长春:吉林大学,2013.

[11] 颜礼有.连翘苷和连翘酯苷对D-半乳糖致衰老小鼠保护作用的研究[D].西安:陕西师范大学,2014.

[12] 李双,王东强,李志军.连翘主要有效成分的提取与药理作用连翘主要有效成分的提取与药理作用[J].黑龙江中医药,2011,40(2):46-48.

(责任编辑：陈翔)

Optimization of extraction technology ofForsythiasuspensaleaves

WANG Yaheng,YAO Ning,WANG Long,SHI Qiaoqiao,BAI Jiqing,WANG Xiaoping

(SchoolofPharmacy,ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,China)

Objective To optimize the better extraction technology ofForsythiasuspenseleaves and lay the foundation for the preparation ofForsythiasuspenseleaves instant tea. Methods TheL9(34) orthogonal test was used to evaluate the effects of ethanol concentration,solid-liquid ratio,reflux time and reflux times for phillyrin,forsythoside A,rutin and the yield of dry extract. Results The optimal extraction process was as follows: 6 times the volume fraction of 50% ethanol,extracting 2 times,0.5 h for each time,and the extracting times had significant effect on the extraction technology ofForsythiasuspenseleaves. Conclusions The optimized extraction process was stable and reliable which could provide a reference for further preparation of instant tea leaf Forsythia.

Forsythiasuspensaleaves; extraction technology; orthogonal design; phillyrin; forsythosideA; rutin; yield of dry extract

2016-05-07

科技部项目(11C26216103652)；工业和信息化部项目([2012]369号)；陕西省科技厅项目(2014K14-01-01)；2014年陕西省大学生创新训练项目(1571)；陕西省教育厅资助项目(2013JK0834)

王亚恒(1991—)，男，2015级硕士研究生，Email：1160802809@qq.com；通信作者：王小平(1976—)，女，博士，教授，硕士生导师，从事中药质量评价及新药开发研究，电话：029-38185165，Email：wangxiaoping323@126.com。

时间：2016-09-28 10:21

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160928.1021.001.html

R284.2

A

1006-8783(2016)05-0586-03

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050701