microRNA218 在胶质瘤的表达水平及对胶质瘤细胞生物学功能的影响

姚雪峰，常会民，邱伟，胡辉华，郭志旺，彭为华

(武警广东总队医院 神经外科，广东 广州 510507)



microRNA218 在胶质瘤的表达水平及对胶质瘤细胞生物学功能的影响

姚雪峰，常会民，邱伟，胡辉华，郭志旺，彭为华

(武警广东总队医院 神经外科，广东 广州 510507)

目的 探讨microRNA218在胶质瘤中的表达水平及对胶质瘤细胞生物学功能的影响。方法 收集人脑胶质瘤标本，运用qRT-PCR检测microRNA表达水平，并将其与胶质瘤病理分级进行相关性分析。采用CCK-8细胞计数法检测胶质瘤细胞活力。结果 microRNA218在胶质瘤中的表达显著下调，并与病理分级呈负相关。microRNA218在胶质瘤细胞中过表达后，细胞的存活率显著降低。结论 microRNA218表达水平与胶质瘤病理分级呈负相关,microRNA218在胶质瘤细胞增殖过程中发挥了重要作用，为了解胶质瘤的发生发展机制研究提供了新的依据。

microRNA218； 胶质瘤； 增殖

据统计，中枢神经系统肿瘤中脑肿瘤占90%[1]，其中胶质瘤是最常见的脑肿瘤。胶质瘤具有高度的侵袭、迁移及增殖能力[2]，但其分子机制很复杂。临床上治疗脑肿瘤的方法或药物非常有限，大多数诊断为脑胶质瘤的患者生存期不到1年，对于多形性恶性胶质母细胞瘤，患者的生存率较低[3]。因此，探索脑胶质瘤的侵袭和转移机制，寻找更有效的治疗方法和药物是十分必要的。

microRNA是一类18～25个核苷酸长度的非编码单链小RNAs，通过调控特定的有活性的mRNA靶点，在恶性肿瘤的进展过程起重要的作用[4-5]。近年来，microRNA218已被在多种肿瘤中广泛研究[6-7]，其在人脑胶质瘤组织中表达下降。然而，microRNA218对人脑胶质瘤细胞生物学功能影响的研究较少。本文研究microRNA218在恶性胶质瘤中的表达及其细胞生物学功能，以期为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞系和试剂

胶质瘤细胞系U87MG、U251MG均购自美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)，并培养在含有10%(φ)胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基上，置于37 ℃，5%(φ)CO2恒温箱(Thermo Fisher)培养。RNAsimple总RNA试剂盒购自中国北京TIANGEN生化科技公司；SYBR Premix ExTaq Ⅱ购自中国大连Takara公司；ABI7500 Real-time PCR system购自美国Applied Biosystems 公司。

1.2 胶质瘤组织样本

胶质瘤标本均来自于武警广东总队医院神经外科手术切除的新鲜胶质瘤组织。实验共收集经病理诊断为脑胶质瘤的原发性胶质瘤组织标本38例，其中按WHO(World Health Organization)中枢神经系统肿瘤分类[8]Ⅰ级7例,Ⅱ级11例,Ⅲ级10例，Ⅳ级10例。样品采集后迅速置于冻存管中液氮保存，6 h后转移至-80 ℃冰箱备用，用于总RNA的提取。

1.3 microRNA218表达载体的构建与转染

人microRNA218序列被扩增并克隆到pcDNA3.1载体上，构建为pcDNA3.1-microRNA218质粒。扩增microRNA218基因上下游引物的序列见表1。不同量(0.05～0.4 μg)的microRNA218重组质粒及空白对照质粒分别转染U87MG和U251MG细胞，依据Lipofectamine 2000(Invitrogen)使用说明书完成细胞转染。

表1 Quantitative RT-PCR 引物序列Table 1 Quantitative RT-PCR primer sequence

1.4 细胞活性测定

使用CCK-8细胞计数法检测细胞存活率。将细胞铺在96孔细胞培养板，5 000个细胞/孔，加入含10% FBS的DMEM，置于37 ℃，5%CO2恒温箱培养24 h。然后将质粒pcDNA3.1-microRNA218转染进入细胞，继续培养24 h。更换为DMEM无血清培养基，并加入0.1%FBS，每孔添加10 μL CCK-8溶液，继续培养在37 ℃的新培养基中。4 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。将不同浓度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 μg)的microRNA218重组质粒及空白对照质粒分别转染U87MG和U251MG细胞，使用CCK-8细胞计数检测转染后胶质瘤细胞的存活率。

1.5 RNA提取和实时定量RT-PCR

根据RNAsimple总RNA试剂盒说明书提取总RNA。按照SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System的说明书进行逆转录。以cDNA为模板，使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ在ABI7500 Real-time PCR system上进行PCR反应,记录荧光定量Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数)，以β-actin为内参，采用2-△△Ct法，计算表达倍数相对差异。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 microRNA218水平与胶质瘤病理分级的关系

运用qRT-PCR检测胶质瘤组织样本中microRNA218的表达水平，结果见图1。图1 A显示WHO I 胶质瘤患者的microRNA218表达水平明显高于WHO Ⅲ和WHO Ⅳ患者(P<0.001)； WHO Ⅱ胶质瘤患者的microRNA218表达水平同样明显高于WHO Ⅲ和WHO Ⅳ患者(P<0.01，P<0.05)。microRNA218表达水平与胶质瘤病理分级呈负相关(图1Br=-0.965 4，P<0.01)。

2.2 microRNA218对U87MG和U251MG细胞增殖的抑制作用

结果表明在U87MG和U251MG细胞中，与转染空载体pcDNA3.1的对照组相比，转染 0.15 μg pcDNA3.1-microRNA218质粒组的细胞增殖均显著下降(图2)，且下降趋势持续到0.2 μg组，且0.2 μg组细胞的增殖水平最低。

A.定量RT-PCR检测脑胶质瘤组织标本中microRNA218表达； B. microRNA218表达与胶质瘤的组织样本病理分级的相关分析。

图1 microRNA218的表达水平与脑胶质瘤组织标本病理分级的相关性Figure 1 Correlation between microRNA218 expression and pathological grading in glioma tissue samples

与转染空载体的对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01。

图2 U87MG和U251MG胶质瘤细胞分别转染不同量的microRNA218重组质粒及空白对照质粒后的细胞存活率

Figure 2 Viability of U87MG and U251MG glioma cells after transfected with different amounts of microRNA218 or blank pcDNA3.1 plasmids

3 讨论

60%的人类基因由microRNA调控转录抑制和(或)mRNA降解来调控[9-10]。越来越多的研究表明，miRNA可以调控许多基因并参与肿瘤的发生发展[11-12]。一些特异性致病相关途径是通过探索肿瘤相关micorRNAs而发现。近年来，microRNA218在肿瘤细胞中发挥的作用逐渐成为研究的热点。

microRNA218是一类重要的微小RNA，有两种编码基因，即has-microRNA281-1和 has-microRNA 281-2，分别定位于染色体4p15.31的slit2基因和染色体5p35.1的slit3基因的内含子中。尽管has-microRNA281-1和 has-microRNA281-2基因的编码序列不同，但两种之间具有高度的同源性，两者转录产生的pri-miRNA经过剪切形成的成熟microRNA218的碱基序列完全相同。microRNA218在哺乳动物的许多正常组织中表达，在脑组织的表达水平最高[13]。有研究表明microRNA218在鼻咽癌、膀胱癌、胃癌胶质瘤组织中表达明显下调，且与临床分期负相关[14]。在多个类型的实体肿瘤组织中恢复microRNA的表达水平能够有效抑制肿瘤的生长。这些研究均提示microRNA218的表达水平与某些肿瘤的恶性表型密切相关。本研究检测了人胶质瘤组织中microRNA218的表达水平及其与胶质瘤病理分级的相关性，发现microRNA218表达水平与肿瘤病理分级呈负相关，提示microRNA218与胶质瘤的进展有关联。因此推测microRNA218可能作为恶性胶质瘤的诊断和预后的一个有价值的标志物。

He等[15]发现microRNA218通过调节BMI1的表达促进结肠癌的凋亡，Li等[16]证实microRNA218可以抑制宫颈癌细胞的增殖，而其在胶质瘤细胞中的生物学作用还尚未被研究。本研究探讨了microRNA218对胶质瘤细胞增殖功能的影响。CCK-8细胞计数分析表明，microRNA218过表达后两种胶质瘤细胞(U87MG和U251MG细胞)活性显著被抑制，当转染表达microRNA218的质粒量达到0.2 μg时，细胞增殖水平最低。结果提示与在宫颈癌细胞和结肠癌细胞一样，在胶质瘤细胞中，microRNA218同样发挥了抑制细胞增殖的作用，而microRNA218通过何种信号通路发挥作用还有待于进一步探讨。

总之，microRNA218表达与胶质瘤病理分级呈负相关，microRNA218过表达可减低胶质瘤细胞的增殖能力，本研究为探讨胶质瘤发展机制和治疗策略提供了新的思路。

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(责任编辑：幸建华)

Expression of microRNA218 in glioma and its effect on the biological function of glioma cells

YAO Xuefeng,CHANG Huiming,QIU Wei,HU Huihua,GUO Zhiwang,PENG Weihua

(DepartmentofNeurosurgery,GuangdongProvincialCorpsHospital,ChinesePeopleArmedPoliceForces,Guangzhou510507,China)

Objective To investigate the expression of microRNA218 in glioma and its effect on the biological function of giloma cells. Methods The expression of microRNA218 in human glioma samples was analyzed by quantitative RT-PCR. The correlation between microRNA218 expression and pathological grading in glioma samples was analyzed. Glioma cell viability was detected by the CCK-8 cell counting assay. Results The expression of microRNA218 was significantly downregulated in glioma samples and negatively correlated with the pathological grading. The cell viability was significantly decreased in microRNA218-treated cells when compared with untreated cells. Conclusion The level of microRNA218 is lowered in glioma samples and negatively correlated with the pathological grading,which may provide a reference for study of the pathogenesis of glioma.

microRNA218; glioma; proliferation

2016-07-14

姚雪峰(1968—)，男，博士，副主任医师，主要从事神经外科临床与基础研究,Email:doctoryxf@sina.com。

时间：2016-10-21 15:51:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161021.1551.004.html

R739.41

A

1006-8783(2016)05-0643-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016071402