耳蜗螺旋神经节细胞形态及计数的研究进展



·综述·

耳蜗螺旋神经节细胞形态及计数的研究进展

肖茜1刘洋1闵美平1荣威林2综述张志远1审校

网络出版时间：2016-2-116:19

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160201.1619.024.html

哺乳动物及人的耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells，SGCs)位于耳蜗骨螺旋板和蜗轴基部的Rosenthal小管内，其外周突通过骨螺旋板内的小管进入螺旋器分布于内毛细胞和外毛细胞。SGCs的主要功能是将耳蜗毛细胞机电转换的信息向听觉系统各级中枢传递[1]。内耳受损后会以SGCs数目变化为特征表现，噪声、年龄老化和耳毒性药物等损伤因素均会造成SGCs突触退化、轴索变性及胞体的损伤，从而影响听力，造成人类不同程度的交流障碍[2]。对耳蜗螺旋神经节细胞的形态学观察及计数能更好地研究耳蜗受损后的病理生理机制和定量反映内耳的损伤程度，因此，本文就近年来关于耳蜗螺旋神经节细胞的形态及计数研究进展综述如下。

1耳蜗螺旋神经节细胞形态的研究

1.1螺旋神经节细胞的正常形态及数目螺旋神经节细胞是耳蜗听觉传导通路的重要组成部分，其将毛细胞的机械振动转换为电信号进而传入听觉中枢产生听觉。听觉传导通路的任何部位病变都将影响听功能[3～5]。不同物种，如：人[4]、猫[6]、鼠[7]、猴[8]等的SGCs形态结构是相似的，但数目却不同，不同种属的螺旋神经节细胞的数目见表1[9～11]；从表中可见不同物种在不同计数方法下的螺旋神经节细胞数目不同。根据其形态结构及其周围突的不同，可将SGCs分为Ⅰ型和Ⅱ型神经元。Ⅰ型神经元胞体较大，为双极神经元，占神经节细胞总数的90%～95% , 胞体内富含核糖体、内质网和高尔基体，胞核大而圆，颜色较暗沉，位于胞体中心，胞体及周围突有髓鞘包绕，周围突与内毛细胞底部共同构成汇聚型突触联系；Ⅱ型神经元胞体较Ⅰ型细胞小，形态多变，为双极或假单极，占总数的5%～10%，其胞质为高度细丝状，细胞器较少，其细胞核颜色较深，胞核可呈分叶状，位置多变，一般无髓鞘或仅有薄层髓鞘包绕，周围突与外毛细胞形成突触联系[4,12,13]。通过光镜定位Rosenthal 小管，发现其中细胞核大而核仁明显者即为SGCs[14]；如果想鉴别SGCs的两种细胞类型，则需用电镜观察其形态特征进行区分[7]。

表1　不同物种的螺旋神经节细胞数目

1.2螺旋神经节细胞损伤后形态及听功能变化听觉系统老化、耳毒性药物、强噪声等因素均可导致内耳组织，如：毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞等出现凋亡、坏死[15]。在年龄相关性变化中，刘强和等[16]观察到小鼠的SGCs胞体变小，周围髓鞘崩解断裂，部分细胞胞核浓缩，并且计数TUNEL染色阳性率，即凋亡细胞的比率约为11.364%±4.96%，其ABR反应阈提高了20 dB；猕猴随年龄增长SGCs的密度减小，并且高频听力逐渐下降[8]；聂深等[17]给小鼠注射卡那霉素联合呋塞米后，在电镜下可见典型的SGCs变性，且其ABR反应阈较正常鼠提高40 dB左右；在卡那霉素作用下，豚鼠SGCs髓鞘逐渐退化消失，细胞数逐渐减少，尤其是底回[10]；在噪声暴露后，在电镜下可见SGCs胞核固缩，胞浆出现空泡化，线粒体肿胀，粗面内质网脱颗粒，部分细胞核结构被吞噬细胞吞噬[18]；观察缺血缺氧性脑病小鼠耳蜗的超微结构，可见细胞形态异常及细胞膜不规则，部分区域的胞质变质及周边卫星细胞形态改变并出现听力下降[19]。由此可见，不同因素导致的SGCs损伤有着相同的病理过程，即损伤后会出现相应程度的SGCs形态变异甚至坏死，使SGCs数目减少；这种变化最早出现在线粒体，随后出现胞核、胞质及其他细胞器的变性，并可导致不同程度的听力损伤；在光镜下可见SGCs数目减少，胞体变小，胞核缩小，髓鞘退化；而特殊TUNEL染色能够检测细胞DNA的断裂，PI细胞核染色能够敏感的检测出细胞凋亡，在电镜下典型的变化是细胞器尤其是线粒体肿胀、消失，胞质空泡化，胞核皱缩；而细胞凋亡是SGCs在损伤状态下死亡的主要方式。

2螺旋神经节细胞计数方法

2.1标本选取观察计数螺旋神经节细胞之前，先要对耳蜗进行取材，不同的取材方式对SGCs的计数影响不同。单纯进行螺旋神经节细胞观察计数，可以随机选取耳蜗，行中轴超薄切片进行观察，而大部分对螺旋神经节的研究中同时需要对毛细胞进行观察计数，这就涉及到是要在不同个体上，还是同一个体不同耳蜗上，或者同一个体同一耳蜗上进行两者的观察；有学者[20]收集4组豚鼠耳蜗，经脱钙后，从各组选取3个耳蜗进行基底膜铺片，另选5个耳蜗行耳蜗中轴切片，发现该方法收集的耳蜗忽略了个体差异，所以其最终结果的可靠性会降低。Keithly[21]选用小鼠的一侧耳蜗取其基底膜用于毛细胞观察，另一侧耳蜗行中轴连续半薄切片观察计数SGCs，该方法可减少抽样误差，对于提高实验可靠性及效率，不失为一种有效的变通方法。Spoendlin等[22]将猫及豚鼠的耳蜗整体包埋，在镜下沿耳蜗中轴将耳蜗一切为二，然后从顶回至底回逐渐切下每回，获得含完整的螺旋器、前庭膜以及螺旋神经节组织的包埋块，将包埋块直接于镜下观察螺旋器，或将其连续切片用于观察SGCs；该方法可观察同一耳蜗上毛细胞和SGCs的变化，有利于发现病变的起始部位及其发展规律，但是在切分耳蜗的同时会有SGCs的缺失，影响SGCs计数。Bohne等[23]将栗鼠耳蜗包埋之后沿平行基底膜盘旋方向从蜗顶向蜗底将基底膜切片，取下的基底膜切片铺片行毛细胞观察计数，保留的蜗轴制备成连续切片用于螺旋神经节细胞观察计数，该方法避免了大量SGCs的物理损伤，但是制备过程比较繁杂，容易损伤神经纤维孔，且需要很精准的技术。Johnsone等[24]选取小鼠的整个耳蜗作为标本，不进行切片处理，在三维结构下观察细胞形态结构及计数，该方法保留了耳蜗立体结构且可将耳蜗组织细胞损伤的几率降到最小。可见，对标本的选取应依照目的要求来进行，但是在允许的条件范围内应尽可能将各种影响因素降到最低，从而使实验结果更准确。

2.2螺旋神经节细胞计数方法

2.2.1直接镜下人工计数法早在二十世纪三十年代Howe[25]用光学显微镜观察细胞轮廓直接计数SGCs，到二十世纪六七十年代后该方法应用开始增多，并且沿用至今。直接镜下人工计数法是对耳蜗中轴进行连续切片，计数每个样本中的螺旋神经节细胞数目；由于相邻切片的螺旋神经节细胞数量变化不大，故改为间隔数张切片进行观察计数[26,27]；还有学者采用分别计数各回的螺旋神经节细胞数以避免因细胞分布不均造成的误差。另外，有国内学者采用目镜加网格片的方法，在40×10倍光学显微镜下对10 μm×10 μm小格内的螺旋神经节细胞进行计数，算出8个网格面积范围内的有核神经节细胞数，然后取连续4张中轴切片的均数[28]。Schettino等[29]利用小格面积为2 500 μm2的网格片覆盖在切片上，每个标本计数9到15个小格有核细胞数然后取其均数，算出螺旋神经节细胞的密度。网格法能够节约大量的时间，但因同一个中轴切面上，神经节细胞的分布是不均匀的，存在有效面积和无效面积(SGCs在耳蜗内的分布并不完全均一，尤其是在细胞受到损伤的情况下，有些局部区域会出现只有少量或是没有细胞的情况，和网格计算出来的细胞密度相差很大，在这种情况下该部位为一个无效面积)，其结果可能存在计量误差。可见直接镜下人工计数法既有其优点，但也存在不可忽视的缺点。

2.2.2计算机图像辅助计数法在二十世纪八九十年代，国内外学者纷纷应用电脑截取图像的计数方法来辅助计数。方耀云等[30]在光学显微镜下扫描切片，将图像传输至图像监视器上，将原始图像经计算机图像处理软件进行增强处理后，使细胞轮廓更清晰，便于观察计数，将细胞核轮廓清晰者计数，在图像监视器上将SGCs逐个标记。该法联合计算机，将已经计数的细胞进行标记，能够避免重复计数或遗漏，并且可以多人同时进行计数，但与直接镜下计数法一样需要耗费较多的精力和时间。

2.2.3计算机软件自动分析计数法从二十世纪九十年代开始出现应用软件自动计数的方法，该方法首先对耳蜗行间隔取片处理，染色，镜下观察，用连接显微镜上的摄像机摄取图像，先用选定的细胞作为模型，设置相关参数，然后直接应用图像处理软件对视野范围内符合条件的细胞自动计数[31,32]；Nie等[33]对耳蜗中轴连续切片，每5张切片中挑出一张进行计数，分别计算耳蜗各回的螺旋神经节数目，测量Rosenthal小管的面积，测量该小管内的细胞数，求其密度，取均值。该方法与之前测量整个中轴的螺旋神经节数目相比，能够更准确的反映SGCs数目的变化，消除了耳蜗不同部位SGCs数量不同的影响，能够精准的反映有效面积下SGCs的分布。然而，图像处理软件往往很难区分染色效果欠佳的细胞或因病变而形态结构、大小及着色异常的受损细胞，尤其是在混有不同的组织细胞部位，所以在软件自动计数的时候往往需要人工随时纠正其识别误差以增加结果的准确率及可信度。目前该法是研究SGCs应用最广的计数方法。

2.2.4连续切片三维结构重建法二十一世纪初期以来，有部分学者利用三维重建法对SGCs进行计数。该法对所获得的耳蜗组织连续图像通过计算机进行提取轮廓及分割处理，构建其三维立体图形并进行细胞定量。Schettino等[29]应用数学关系的体视学法(design-based stereology)将耳蜗立体结构重建并观察和计量螺旋神经节细胞数和密度，其方法是取下耳蜗，经固定、脱钙、梯度脱水及包埋后，以40 μm的厚度沿平行中轴方向切片，逐一拍摄，重建时通过SI软件的辅助下对中轴连续切片进行重建，得到重建的三维模型，计数出小鼠的SGN细胞数和密度，并与以往的其他计数方式结果进行对比研究，差别无统计学意义。Richter等[9]将耳蜗沿蜗轴水平切片，将切片染色后按顺序拍照，将一系列切片进行重建，应用数字化成像联合Adobe Photoshop处理软件进行计数，首先标示出第一张切片上所有SGCs及该切面标示性的轮廓，计数SGCs数目，然后将标示出的简易图与第二张切片图进行整合，再对该图中没有标示的所有SGCs进行标记，将标示简易图整合至下一张切片，以此类推，将得到的所有SGCs数目累积相加。利用数字化成像及软件辅助三维成像的方法能够比较精确的计量细胞数，减少计量误差，不仅能够获取二维切片的图像而且能够将耳蜗组织结构立体化，能够更加直观的对其观察。

2.2.5耳蜗整体三维成像法近年有部分学者应用共聚焦显微镜联合电脑辅助软件，制作完整耳蜗的三维立体结构图进行内耳相关研究。Wrzeszcz等[34]将整个豚鼠耳蜗经固定，漂洗，脱钙，梯度酒精脱水，MSBB浸泡过夜处理之后，利用激光共聚焦显微镜(laser imaging microscopy，CLSM，LSCM)对标本进行扫描摄片，由顶回至底回逐层扫描，整个过程需耗时3～4个小时，将拍摄图像传入与之相连的计算机，利用XuvTool软件对重叠部位进行处理，将其处理为一个完整的三维中轴图像，可以将蜗轴进行360°旋转观察，制成的图像以图片或视频方式输出保存，利用专门计数胞核的ITCNplug-in软件对SGCs计数。Johnson等[24]将整个猫的耳蜗进行荧光染色，利用薄层激光成像显微镜(thin layer of laser imaging microscopy，TSLIM)拍摄从顶回至底回的耳蜗图片，再利用专门的软件分析整合为一个立体的耳蜗图，可以计数总的SGCs，并可对每个距离长度的细胞进行计数，可以更加详细的了解耳蜗每个部位SGCs具体数目并进行比较分析。Schmitz等[11]利用TSLIM观察药物性聋小鼠的耳蜗结构，在1.5 μm×1.5 μm×1.5 μm的像素下，按B样曲线模式(电脑辅助设计软件中用于决定几个点之间的曲线走行及曲线弧度的一种数学表示法)沿基底膜从底部到顶部扫描2次，一次是myosin VIIa染色后，一次是异硫氰酸罗丹明B染色之后；图像经Amira软件处理将耳蜗整体结构重建之后，观察毛细胞及螺旋神经节细胞的形态、大小、损伤的具体部位以及整个耳蜗组织细胞的三维形态。该法能够使细胞更形象，更易辨认，计数更精确，尤其是将细胞适当的染色之后，能够在几乎不损伤组织结构的情况下对细胞进行形态观察及计数，形象的展示耳蜗组织细胞的空间位置及形态特征，增加人们对耳蜗的立体结构的认识，是一种比较理想的计数方法。

在各类理化因素的影响下，螺旋神经节细胞可出现不同程度的退行性变，观察螺旋神经节细胞的形态变化及计数能够对其损伤定性及定量。目前，单纯镜下计数法已较少应用；对耳蜗超薄切片进行图片分析联合相关的细胞计数软件进行计数的方法因其简单、省时，目前应用较广；三维立体重建法能够清楚地呈现耳蜗立体空间结构及局部组织细胞的形态特征，并且可以精确的定量分析，但因其对相关实验条件，如：仪器设备以及辅助软件的要求较高，目前应用还比较少。因此，综合分析这些实验技术的优缺点，从中选择一个简单而又精确的方法观察并计数螺旋神经节细胞，将为以后实验及临床研究提供参考依据。

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(2015-04-07收稿)

(本文编辑雷培香)

【中图分类号】R322.9+23

【文献标识码】A

【文章编号】1006-7299(2016)02-0203-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.02.023

通讯作者：张志远(Email：zzyent@126.com)

1南昌大学第一附属医院耳鼻咽喉科(南昌330006)；2南昌大学第一附属医院神经外科