基于核壳金@铂纳米粒子的Ag+比色检测方法

陈铭铭，吴亮亮，谢正军，彭池方

(江南大学 食品学院 食品科学与技术国家重点实验室 ，江苏 无锡 214122)

基于核壳金@铂纳米粒子的Ag+比色检测方法

陈铭铭，吴亮亮，谢正军，彭池方*

(江南大学 食品学院 食品科学与技术国家重点实验室 ，江苏 无锡 214122)

金核铂壳纳米粒子(Au@Pt NPs)具有出色的类过氧化物酶活性，而Ag+对其催化活性表现出强烈的抑制；基于此，构建了高灵敏的Ag+比色检测方法。在最佳反应条件下，Au@Pt NPs比色检测Ag+的线性范围为0.1～10 nmol/L，检出限可达0.05 nmol/L。该方法对汞离子(Hg2+)也表现出高灵敏的响应，比色检测Hg2+的线性范围为10～200 nmol/L。将其应用于实际水样中Ag+的检测，在添加浓度为10，50，100 nmol/L时，回收率为83.8%～97.7%，相对标准偏差为3.0%～9.6%，该方法具有操作简单、灵敏度高、成本低等优点。关键词：Au@Pt纳米粒子；模拟酶；比色检测；银离子；汞离子

Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

银是一种人们熟知的重金属，因其具有良好的导电、导热、延展性以及反光性，而被广泛地应用于电子、影像等行业[1]。但是，全球每年含银废液的排放量高达2 500吨，其中约有150吨的废液以淤泥的形式被排放，约80吨的废液进入地表水中[2]。由于银离子与巯基、氨基基团有良好的亲和力，所形成的复合物会累积到肝、皮肤和毛发中[3]，因此，一旦长期暴露在高浓度的银离子环境中，会对生物体造成一定的损害[4-5]。而与其他形式相比，银的离子状态(Ag+)毒性最大[6]。目前常用的Ag+检测方法主要包括原子吸收分光光度法[7]、电化学法[8]、原子发射光谱法[9]、电感耦合等离子体质谱法[10]、高效液相色谱法[11]。但这些方法均存在不同的弊端，如耗时较长、仪器昂贵、需专业操作人员、不便携带等[12]。因此，开发经济、简单、高灵敏和高选择性的Ag+检测方法，具有重要的应用价值。 近年来，纳米技术的发展为研究者开发重金属离子的检测方法提供了新思路。人们基于纳米粒子的特性设计开发了许多Ag+的检测方法。如刘毅等[13]利用富含C，G碱基序列的DNA在荧光染料硫黄素T(ThT)的诱导下折叠成四链体结构，并加强ThT的荧光强度，而Ag+则可以破坏这一四链体结构，基于此设计了一种新型免标记Ag+传感器；He等[14]利用Au-N之间的相互作用合成肌酐-纳米金粒子，这种纳米金由于粒径小而只能产生较弱的等离子共振峰，加入Ag+后，等离子共振峰增强且纳米金由无色变紫色，基于此建立了比色方法检测Ag+；Yang等[15]利用Ag+能和富含C碱基的DNA构成C-Ag+-C结构而被绿色荧光染料识别，构建了一种简单快速检测Ag+的方法。尽管上述各类基于纳米粒子的光学和电化学等特性，成功开发了许多性能出色的方法，但是，目前报道的Ag+比色检测方法的灵敏度和特异性等还需进一步提高。

研究表明，一些金属纳米粒子(NPs，如Fe3O4NPs、Pt纳米簇、Co3O4NPs等)具有出色的类似天然酶的活性[16]，人们称其为“纳米模拟酶”，如铂纳米材料含有超氧化物歧化酶活、过氧化氢酶活、氧化酶活和过氧化物酶活4种酶活[17]。Fan等[18]利用去铁蛋白包被合成含74% PtO和26% Pt2+的Pt纳米粒子，它对TMB的米氏常数为0.22 mmol/L，对H2O2的米氏常数为187.25 mmol/L。Fu等[19]以DNA为模板合成2.9 nm的Pt纳米酶，其对TMB的亲和力是辣根过氧化物酶的8倍。与天然酶分子相比，纳米模拟酶不仅价格便宜，而且对热、酸、碱的耐受性高[20]。因此，纳米模拟酶的应用获得了广泛关注；并且，基于金属纳米粒子的类酶特性，研究建立了一些重金属离子的检测方法。如Li等[17]利用Hg2+与牛血清蛋白包裹的铂纳米颗粒之间存在相互作用，从而能够抑制铂纳米粒子的催化活性，构建了一种灵敏检测Hg2+的方法。Yang等[21]研究发现MnO2纳米棒可作为氧化酶模拟物催化TMB产生阳离子自由基，谷胱甘肽会阻碍阳离子自由基的产生使TMB由蓝色变为无色，而Hg2+的存在会导致TMB溶液重新显色。基于此，该课题组研究出一种简单快速检测Hg2+的方法；Li等[22]基于Pb2+会与含T30695核苷酸序列的Au纳米粒子形成Au-Pb合金及核苷酸-Pb2+复合物而增强Au纳米粒子的过氧化物酶活性，建立了Pb2+的检测体系，其检测限低至0.05 nmol/L；同样，Pb2+结合到儿茶素修饰的金纳米颗粒上会形成Pb-儿茶素复合物以及Au-Pb合金，从而增强金纳米颗粒的过氧化物酶样活性催化AUR显色，Wu等[23]利用此原理检测了湖泊、池塘和尿液中的Pb2+含量。

本文则利用Au@Pt NPs的高过氧化物酶活性以及Ag+对其催化活性的强烈抑制作用，构建了高灵敏的Ag+比色直接检测方法。该方法具有操作简单、稳定性高、超高灵敏以及低成本等优点。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

氯金酸、5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、柠檬酸三钠(美国Sigma公司)；L-抗坏血酸、六氯铂酸钾(阿拉丁公司)；过氧化氢(H2O2)溶液、一水合柠檬酸、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠为国药分析纯试剂；汞、锰、锶、锌、铁、钴、铬、铜、铋、镍、镉、铝、钡、铅等单元素标准品购自中国科学计量研究院；实验用水为18.2 MΩ·cm的Millipore超纯水。上述试剂除了特殊说明外均为分析纯。

Biotek Eon微孔板分光光度计(美国Biotek公司)；JEM-2100透射电镜(日本电子株式会社)；UV-2802pcs紫外光谱仪(美国优尼柯公司)；Multiskan MK3 酶标仪(美国Thermo公司)；Eppendorf可调式移液器(美国艾本德产品)；恒温振荡器(无锡沃信仪器有限公司)；电子天平、数显pH计(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司)；XW-80A微型旋涡混合仪(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 Au@Pt NPs的合成 Au NPs的制备：于一个洁净的锥形瓶中，加入97.5 mL 水和2.5 mL 氯金酸溶液(0.4%)，匀速搅拌、加热，沸腾5～6 min 后，快速加入2.0 mL 1.0%柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌，溶液从无色变为灰色再变为红色时，待到颜色稳定继续加热10 min后，停止加热，继续搅拌，冷却至室温，放入4 ℃冰箱备用[24]。计算AuNPs溶液的初始浓度为3.0 nmol/L[25]。

Au@Pt NPs的制备在参考文献的基础上略作改动[26]。具体如下：于一个洁净的锥形瓶中，加入30 mL 上述合成的Au NPs溶液，再加入10 mL 1.0 mmol/L的六氯铂酸钾溶液，加热至80 ℃。之后缓慢加入10 mL 5 mmol/L的L-抗坏血酸溶液，匀速搅拌30 min，待溶液由红色变咖啡色后，停止加热，持续搅拌，冷却至室温，放入4 ℃冰箱备用。计算Au@Pt NPs溶液的初始浓度约为1.2 nmol/L。

1.2.2 Ag+的的检测 将Au@Pt NPs稀释至10倍，取100 μL，加入425 μL超纯水和175 μL磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L，pH 7.0)，混合均匀后标记为A溶液；向390 μL超纯水中，加入1 170 μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)，560 μL氢氧化钠溶液(10%)，以及880 μL的TMB溶液(1 mmol/L)，混合均匀标记为B溶液。取20 μL A溶液加入酶标板微孔中，加入80 μL不同浓度的Ag+溶液，轻轻混合，室温振荡反应20 min，再加入100 μL的B溶液，室温振荡反应15 min。最后，通过酶标仪在652 nm处读取反应液的吸光值(A652 nm)；以吸光值对Ag+的浓度绘制校正曲线。

a.black solution at CPE，b.CAP at CPE，c.CAP at GR-CPE，

d.CAP at GR/SDS-CPE

2 结果与讨论

2.1 Au@Pt NPs的表征

采用吸收光谱(UV-Vis)对AuNPs和Au@Pt NPs进行分析。从图1可以看到，AuNPs的吸收峰在520 nm处(曲线a)，当加入六氯铂酸钾和L-抗坏血酸后，溶液由红色变成咖啡色，在紫外图上无明显的吸收峰(曲线b)。通过透射电镜(TEM)观察，可见AuNPs粒径约为15 nm，而Au@Pt NPs 的平均粒径为20 nm(图2)。另外，还可观察到Au@Pt NPs的表面非常粗糙。Au@Pt NPs的EDX谱图也表明，有Au和Pt两种元素同时存在。以上结果表明已成功制备Au@Pt NPs。

2.2 Au@Pt NPs比色检测Ag+

单独TMB与H2O2存在时，几乎无吸收峰(见图3)，而加入Au@Pt NPs后，可在652 nm处观察到强烈的吸收，表明Au@Pt NPs具有过氧化物酶活性，能催化H2O2氧化TMB。加入200 nmol/L的Ag+溶液孵育后，吸收峰强度显著下降，表明Ag+能够抑制Au@Pt NPs的催化能力。图3插图为Au@Pt NPs催化TMB-H2O2反应的动态时间曲线，从图3插图可见，Au@Pt NPs可以催化TMB-H2O2显色，具有过氧化物酶活性，且随着时间的延长，吸光值逐渐上升，并在15 min左右趋于稳定。基于上述抑制Au@Pt NPs催化活性的作用，有望发展灵敏的Ag+比色检测方法。为了获得对Ag+更灵敏的响应，考察了磷酸盐缓冲溶液以及底物H2O2和TMB浓度的影响。

2.2.1 磷酸盐缓冲溶液pH值的影响 考察了pH值分别为5.7，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸盐缓冲液对Ag+的响应分析。结果表明，当磷酸盐缓冲液的pH值为7.0时，10 nmol/L Ag+产生的响应所导致的吸光度差值(A0-A)最大。因此后续实验选用pH 7.0的磷酸盐缓冲液用于Ag+检测。

2.2.2 H2O2浓度的影响 考察了不同质量分数(5.0%，6.0%，7.5%，10%,15%,30%)的H2O2溶液对Ag+的响应。结果表明，当H2O2的质量分数为10%时，10 nmol/L Ag+产生的响应所导致的吸光值变化明显高于其它浓度，故选用质量分数为10%的H2O2溶液用于后续的Ag+检测。

2.2.3 TMB浓度的影响 进一步考察了不同浓度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol/L)的TMB溶液对Ag+检测的影响。结果显示，当TMB溶液为1.0 mmol/L时，10 nmol/L Ag+产生的响应所导致的吸光值变化最大。继续提高其浓度，吸光度差值缓慢下降，这一现象与天然酶类似，可能是由于底物浓度过高导致对纳米模拟酶活性抑制的效应。故选用浓度为1.0 mmol/L的TMB溶液用于后续检测。

2.2.4 Ag+检测的标准曲线 在优化的缓冲液和底物条件下，应用Au@Pt NPs检测浓度分别为0，1，2，5，10，20，50，100，150，200，300 nmol/L的Ag+溶液，并以Ag+浓度(X,nmol/L)作为横坐标，以吸光值(Y)作为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，Ag+的浓度在0.1～10 nmol/L范围内与其吸光值呈良好的线性关系，线性方程为Y=-0.023 99X+0.805 64，相关系数(r2)为0.99。以3倍信噪比计算，可得该方法对Ag+的检出限为0.05 nmol/L，远低于我国饮用水设定的限量标准0.5 mol/L[27]。

2.3 Au@Pt NPs检测重金属离子的特异性

为考察该比色检测方法的选择性，选择常见金属离子溶液，包括Hg2+,Mn2+,Sr2+,Zn2+,Fe3+,Co2+,Cr2+,Cu2+,Bi2+,Ni2+,Cd2+,Al3+,Ba2+,Pb2+和Hg2+作干扰离子，检验该方法对Ag+的特异性。结果表明，Au@Pt NPs对500 nmol/L的Ag+和Hg2+显示出强烈的响应，而对其它高浓度的Mn2+，Sr2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Pb2+，Ba2+(10 μmol/L)产生的响应几乎可忽略，对高浓度(10 μmol/L)的Fe3+，Cr2+，Bi2+，Ni2+，Cd2+和Al3+等离子的响应也非常小。该方法对Hg2+的检测范围为10～200 nmol/L，相关系数(r2)为0.99。以3倍信噪比计算，可得该方法对Hg2+的检出限为5.0 nmol/L，满足我国饮用水设定的限量标准5.0 nmol/L[28]。实际测样过程中，可在样品中加入EDTA等络合剂以消除Hg2+对Ag+的干扰。

2.4 样品的加标回收率与相对标准偏差

采集本实验室的自来水作为样品基质，经ICP-MS分析其含量。向该样品中添加不同量的Ag+，使Ag+浓度达到10，50，100 nmol/L。然后用超纯水稀释10倍，经0.22 μm微孔过滤膜过滤后，在优化条件下进行检测。结果显示，其3个加标浓度下的回收率分别为83.8%，90.4%和97.7%，相对标准偏差分别为9.6%，6.4%和3.0%。上述结果表明，应用该Au@Pt NPs在实际样品中检测Ag+具有较高的准确性和可靠性。

3 结 论

本研究基于Ag+抑制Au@Pt NPs的催化活性，构建了一种高灵敏、高选择性检测Ag+的比色法，并考察了磷酸盐缓冲液的pH值，H2O2和TMB浓度对Ag+检测的影响。结果表明，在优化条件下，Au@Pt NPs对Ag+的检测线性范围为0.1～10 nmol/L，检出限为0.05 nmol/L。同时，该方法对Hg2+也显示了良好的响应，对Hg2+的检测线性范围为10～200 nmol/L，检出限为5.0 nmol/L。将该方法应用于添加Ag+的自来水测试，回收率为83.8%～97.7%，相对标准偏差为3.0%～9.6%。该方法检测Ag+具有操作简单、灵敏度高、使用成本低等优点，有望进一步应用于环境中Ag+的检测。

[1] Wen Y Q，Xing F F，He S J，Song S P，Wang L H，Long Y T，Li D，Fan C H.Chem.Commun.，2010，46(15)：2596-2598.

[2] Lee S，Jang K，Park C，You J，Kim T，Im C，Kang J，Shin H，Choi C H，Park J，Na S.NewJ.Chem.，2015，39(10)：8028-8034.

[3] Wang F，Wu Y G，Zhan S S，He L，Zhi W T，Zhou X X，Zhou P.Aust.J.Chem.，2013，66(1)：113-118.

[4] Bian L J，Ji X，Hu W.J.Agric.FoodChem.，2014，62(21)：4870-4877.

[5] Wang H H，Xue L，Qian Y Y，Jiang H.Org.Lett.，2010，12(2)：292-295.

[6] Ding J，Wang Q，Yang X H，Wang K M，Huang J H，Liu P.Chem.Sens.(丁静，王青，羊小海，王柯敏，黄佳浩，刘沛.化学传感器)，2012，(2)：11-15.

[7] Omidi F，Behbahani M，Shahtaheri S J，Salimi S.Environ.Monit.Assess.，2015，187(6)：1-10.

[8] K'owino I O，Agarwal R，Sadik O A.Langmuir，2003，19(10)：4344-4350.

[9] Lin D J，Wu J，Wang M，Yan F，Ju H X.Anal.Chem.，2012，84(8)：3662-3668.

[10] Mudalige T K，Qu H，Linder S W.Anal.Chem.，2015，87(14)：7395-7401.

[11] Mikelova R，Baloun J，Petrlova J，Adam V，Havel L，Petrek J，Horna A，Kizek R.Bioelectrochemistry，2007，70(2)：508-518.

[12] Yang Y，Li W Y，Qi H，Zhang Q F，Chen J，Wang Y，Wang B，Wang S J，Yu C.Anal.Biochem.，2012，430(1)：48-52.

[13] Liu Y，Peng L H，Ren J.J.Instrum.Anal.(刘毅，彭丽华，任昀.分析测试学报)，2015，34(3)：352-356.

[14] He Y，Liang Y，Song H.Plasmonics，2016，11(2)：587-591.

[15] Yang Q，Li F，Huang Y，Xu H，Tang L S，Wang L H，Fan C H.Analyst，2013，138(7)：2057-2060.

[16] Luo C，Li Y，Long J G.Sci.China-Chem.(罗成，李艳，龙建纲.中国科学:化学)，2015，45(10)：1026-1041.

[17] Li W，Chen B，Zhang H X，Sun Y H，Wang J，Zhang J L，Fu Y.Biosens.Bioelectron.，2015，66：251-258.

[18] Fan J，Yin J J，Ning B，Wu X C，Hu Y，Ferrari M，Anderson G J，Wei J Y，Zhao Y L，Nie G J.Biomaterials，2011，32(6)：1611-1618.

[19] Fu Y，Zhao X Y，Zhang J L，Li W.J.Phys.Chem.C，2014，118(31)：18116-18125.

[20] Peng C F，Pan Q L，Xie Z J，Wan F M.J.Instrum.Anal.(彭池方，泮秋立，谢正军，万芳梅.分析测试学报)，2014,33(11)：1312-1316.

[21] Yang H G，Xiong Y H，Zhang P，Su L J，Ye F G.Anal.Methods，2015，7(11)：4596-4601.

[22] Li C L，Huang C C，Chen W H，Chiang C K，Chang H T.Analyst，2012，137(22)：5222-5228.

[23] Wu Y S，Huang F F，Lin Y W.ACSAppl.Mater.Interfaces，2013，5(4)：1503-1509.

[24] Mei Z L，Chu H Q，Chen W，Xue F，Liu J，Xu H N，Zhang R，Zheng L.Biosens.Bioelectron.，2013，39(1)：26-30.

[25] Haiss W，Thanh N T K，Aveyard J，Fernig D G.Anal.Chem.，2007，79(11)：4215-4221.

[26] Gao Z Q，Xu M，Lu M D，Chen G N，Tang D P.Biosens.Bioelectron.，2015，70：194-201.

[27] Xu X Z，Qiao J，Qi L，Wang L L，Zhang S F.Sci.China，Chem.，2015，58(6)：1065-1072.

[28] GB/T 5749-2006.Standards for Drinking Water Quality.National Standards of the People's Republic of China(生活饮用水卫生标准.中华人民共和国国家标准).

Colorimetric Detection of Silver Ions Based on Au@Pt Nanoparticles

CHEN Ming-ming，WU Liang-liang，XIE Zheng-jun，PENG Chi-fang*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and

Au@Pt NPs have an excellent peroxidase-like activity，and silver ions(Ag+) could intensively inhibit the catalytic ability of Au@Pt NPs.Based on this，a colorimetric detection of Ag+was performed in a linear range of 0.1- 10 nmol/L with a detection limit of 0.05 nmol/L.The sensing system also showed a sensitive response to Hg2+.A linear range of 10-200 nmol/L and a detection limit of 5.0 nmol/L were achieved in the colorimetric detection for Hg2+.The method was applied in detection of tap water spiked with Ag+(10，50,100 nmol/L)，and the recoveries ranged from 83.8% to 97.7% with relative standard deviations(RSD) of 3.0%-9.6%.This method has the advantages of simplicity，sensitivity and low cost.

Au@Pt nanoparticles；enzyme mimics；colorimetric detection；Ag+；Hg2+

2016-06-05；

2016-06-20

十二五国家科技支撑计划项目(2015BAD17B02)；国家自然科学基金资助项目(31371767)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.023

O657.3;O614

A

1004-4957(2016)11-1496-05

*通讯作者：彭池方，博士，教授，研究方向：纳米传感分析新技术，Tel：0510- 85919189，E-mail：pcf@jiangnan.edu.cn