便携扫描式荧光仪的研发

赵忠龙，杨志伟，王　海，张　晶，闵小平，*，葛胜祥

( 1．厦门大学信息科学与技术学院，福建厦门361005; 2．厦门大学国家传染病疫苗与诊断试剂研究工程中心，福建厦门361102)



便携扫描式荧光仪的研发

赵忠龙1，杨志伟1，王海1，张晶2，闵小平1，2*，葛胜祥2

( 1．厦门大学信息科学与技术学院，福建厦门361005; 2．厦门大学国家传染病疫苗与诊断试剂研究工程中心，福建厦门361102)

摘要:为了能够实现对血液中特定抗原浓度的即时检测( POCT)，研制了基于时间分辨荧光免疫分析技术的便携式荧光仪．荧光仪以波长为365 nm的紫外LED作为激发光源，经光学结构产生线光斑进行扫描以及激发荧光信号，最后对光电二极管收集的光信号数据进行平滑、求斜率处理．使用该仪器对我们研发的纸条进行检测，并分析其灵敏度，结果表明稀释倍数和检测线面积/控制线面积( AT/AC)之间乘幂关系较好，相关系数为0．994 3．仪器灵敏度、稳定性好，同时成本很低．

关键词:即时检测;时间分辨荧光免疫分析;扫描式荧光仪

目前，体外诊断行业的一个突出特点是它的两极化发展趋势，一极是大型自动化医学检验仪器，另一极是小型即时检测( point－of－care－testing，POCT)仪器．其中，POCT仪器检测过程方便、快速且高效，获得了市场越来越高的认可度，在临床应用中的影响不断扩大［1－3］．

POCT型侧向流纸条检测技术结合定量免疫检测技术在医疗保健、疾病诊断与防治等方面一直发挥着巨大的作用［4－5］．类似的定量免疫检测方法已有相关的报道．例如Li等［6］为量化上转换发光( UCP)粒子并做出其图像，研制出了二维光学扫描系统，并将此系统应用于上转换发光颗粒标记免疫检测．在功率为1．2 W，发光波长为980 nm的光纤耦合激光二极管上覆盖一个透明的微流控芯片就可以激发UCP粒子发光，这种激发光可用光电倍增器( PMT)检测．使用此扫描仪，从X和Y两个方向扫描二维纸条只需要8 min［7］．

本文介绍了一种以时间分辨荧光免疫分析为生物依据的扫描式荧光仪［8－10］．它采用光纤作收发光的通道，光学扫描采用线扫描的方式，避免了点扫描的局部性和不稳定性．采用16位的AD转换器将高灵敏度光电二极管捕捉到的光信号转换成数字信号，并对收集到的数字信号进行分析，建立相关的数学模型，为后面的定量分析做基础．仪器相对其他设备而言，在保证检测灵敏度的同时，成本低、稳定性好．

1实现方法及原理

1. 1时间分辨荧光免疫分析

荧光免疫分析是荧光检测技术和免疫学反应相互结合起来的一种免疫分析方法．其基本实现方法如下:使用某种特异性抗体，在其上标记荧光基团使之成为特异性试剂，与对应抗原结合形成复合物［11－12］．

使用时间分辨荧光免疫技术进行检测时，激发光激发标记物后适当延迟一段时间再对标记物荧光进行检测，可以提升检测灵敏性，降低本底荧光干扰，增强稳定性和特异性．而且还具有线性范围更宽，试剂寿命更长的优点［13－14］．

1. 2荧光仪纸条检测原理

荧光仪纸条检测原理如图1所示:在检测纸条上面贴有一层硝酸纤维素膜，用于固定抗原抗体结构．

纸条前端是质控线( control)，质控线由包被羊抗鼠抗体和单克隆抗体(含荧光微球)组成，包被羊抗鼠抗体可以自动识别单克隆抗体，并形成稳定结构．所以质控线的荧光强度基本固定，用于判断纸条是否合格．

纸条后端是检测线( test)，它由包被单克隆抗体和单克隆抗体组成，这两者不会结合，但是分别都可以和抗原结合，从而形成一个包被单克隆抗体+抗原+单克隆抗体的夹心结构，抗原越多，与之稳定结合固定在硝酸纤维素膜上的荧光微球越多，从而可以判断荧光强度．

图1荧光纸条检测原理Fig．1 Strip detection principle of fluorometer

扫描式荧光仪使用的纸条结构如图2所示．

图2纸条结构平面图Fig．2 Structure of the test strip

2光学设计

光学模块是扫描式荧光仪的核心模块，它控制着仪器信号源，对光信号进行传播和接收，决定着仪器最终检测结果［15］．所以在光学模块设计过程中，需要提高激发光光源工作稳定性，降低激发光传输衰减度．为此，选择高灵敏度光电二极管( ODA－6WB－500M)和石英光纤，具体如图3所示．

从图3可知，发射光源1负责紫外光的产生，滤光片3用于过滤发射光源，光探测单元2负责接收荧光纸条7反射的荧光信号，滤光片4负责对所接收到的光信号进行滤波处理．其中光纤(呈Y型)负责对光形状转换传递等，具体如图4所示．

从图4可知，左端通光2连接LED灯接口，用于传播LED灯发射的紫外光．在最右端将柱形光转成切面为条形的光(长度等于纸条上检测线宽度)，由右端通光2照射到纸条上．

图3光学模块设计图Fig．3 Design of the optical module

图4光纤刨面图Fig．4 Cross－section of the optical fiber

在紫外光的照射下，纸条上的荧光颗粒就会被激发出荧光，右端通光1将此荧光传递给左端通光1供光电二极管接收．

光电二极管将接收到的荧光经过处理，传递给模数转换芯片进行下一步的处理．

3数据处理

3. 1读值检测原理

对纸条进行一次扫描，可以检测到两个荧光波峰，记录下两个波形面积之比，然后利用浓度已知的标准纸条进行大批量生物实验，建立如下数学关系:“检测线面积/控制线面积( AT/AC)～检测物试剂浓度”．最后利用建立起来的数学模型去判断未知的检测试剂浓度．

3．2算法过程

在数学中，针对连续的数学模型，我们使用求导并对导函数分析来获得某曲线的波峰信息．

根据此思想，一次检测完成，获得模数转换以后的1 200个荧光数据点( Data［1 200］)如图5，做如下处理:

图5原始数据示意图Fig．5 Origin data

3. 2. 1平滑处理

对于得到的原始数据，会有锯齿数据存在，对此我们要先进行平滑处理:

3. 2. 2求斜率

过滤掉锯齿数据之后，就可以求Smooth［1 200］的斜率．由于操作点是离散点，所以我们借用求导的原理(图6) :

图6求导原理Fig．6 Principle of derivation

其中: ( x1，y1)，( x2，y2)为相邻的点，这里使用了一个长度为2的窗口进行滑动．当前点的斜率可表示为:

其中，i的取值范围5～1 195．Slope［1 200］如图7所示．

图7斜率示意图Fig．7 Slope data

3．2．3求面积

在求面积之前，首先要找到波峰的起始点．

在求起始点时，为了精确，对Slope数据进行大量实验确定滑动窗口为10，即从Data［i］到Data［i+9］共10个点的平均值作为当前点的斜率．

起点:

要得到终点，就需要先找出开始下降的点．下降点:

终点:

其中，j的范围为: 10～1 190．

最后一步求面积，假设:基线值、波峰宽度、毛面积、净面积依次如下:

通过以上分析，即可得到图5中波峰的信息，具体如表1所示．

4性能分析

表1波峰检测结果Tab．1 Result of peak recognition

为了测试荧光仪的灵敏度，用其来检测血液中丙型肝炎病毒抗原( HCV)的浓度．

控制线( C线)为羊抗鼠多抗，检测线( T线)为12F12抗体(起包被作用)，样品垫中为W4G3抗体(含荧光颗粒，起标记作用)．

在吸收垫的作用下，血液中的HCV抗原、12F12抗体、W4G3抗体在T线处结合均形成稳定结构，W4G3和羊抗鼠多抗在C线处结合成稳定结构．

使用标准纸条进行测试，对已知固定浓度样本按不同比例进行稀释，检测得到AT/AC的值如表2所示．

表2 AT/AC与稀释倍数Tab．2 AT/AC and dilution ratio

由AT/AC与稀释倍数得到乘幂趋势线如图8所示．

由图8可知，AT/AC和稀释倍数之间乘幂趋势线，相关系数R2= 0．994 3，说明在稀释倍数足够大的时候，仪器检测出的值逐渐趋于一致，这与我们预计的一致，也进一步说明该仪器灵敏度高．

5结论

本文主要介绍以时间分辨荧光免疫分析技术为生物检测原理实现扫描式荧光仪的研发．扫描式荧光仪工作时，紫外LED灯发出的光经过光学结构后，以条形光束照射在荧光颗粒标记的纸条上，模数转换器将高灵敏度光电二极管检测到的荧光信号转换成数字信号，交由处理器，至此完成一个条形区域(长4 mm，宽0．8 mm)荧光强度的采集．并设计算法对检测到的离散数据进行处理，构建并根据“AT/AC～检测物浓度”数学关系计算出待检测物质的浓度．通过大量生物实验表明，扫描式荧光仪具有检测速度快、可重复性高、数据线性关系好等优点．此外，根据抗原、抗体结合的特异性，设计出对应的荧光纸条，就能很好地对血液中不同物质进行快速检测，而且仪器采用紫外LED作为激发光源以及光电二极管进行光电转换，大大降低了仪器的成本．

图8 AT/AC与稀释倍数线性关系Fig．8 Dilution ratio AT/AC linear relationship

参考文献:

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Developing a Scanning-fluorescence Reader

ZHAO Zhonglong1，YANG Zhiwei1，WANG Hai1，ZHANG Jing2，MIN Xiaoping1，2*，GE Shengxiang2

( 1．School of Information Science and Engineering，Xiamen University，Xiamen 361005，China; 2．National Institute of Diagnostics and Vaccine Development In infection Diseases，Xiamen 361102，China)

Abstract:We developed portable scanning－fluorescence readers based on the time－resolved fluoroimmunoassay in order to quickly measure the concentration of antigen in blood point－of－care testing ( POCT)．An ultraviolet LED with laser operating at 365 nm is used in our experiment as the thermal source．The special optical structure can form a strip shot，which generated signal from fluorescence excitation．The device subsequently addresses waveform data using a gradient smoothing method．We measured the strips that are made by our laboratory，and show that the dilution ratio and AT/AC reach a correlation index of 0．994 3．The instruments enjoys advantages of high sensitivity，high stability，and low cost．

Key words:point－of－care－testing ( POCT) ; time－resolved fluoroimmunoassay; scanning－fluorescence reader

*通信作者:mxp@ xmu．edu．cn

收稿日期:2015－03－06录用日期: 2015－05－13

doi:10．6043/j．issn．0438－0479．2016．01．023

中图分类号:TH 776

文献标志码:A

文章编号:0438－0479( 2016) 01－0121－05

引文格式:赵忠龙，杨志伟，王海，等．便携扫描式荧光仪的研发［J］．厦门大学学报(自然科学版)，2016，55( 1) : 121－125．

Citation: ZHAO Z L，YANG Z W，WANG H，et al．Developing a scanning－fluorescence reader［J］．Journal of Xiamen University( Natural Science)，2016，55( 1) : 121－125．( in Chinese)