海洋微藻保存方法的研究进展

张文慧，高金伟，姜智飞，范耘硕，周文礼

（天津农学院 水产学院，天津市水产生态与养殖重点实验室，天津 300384）

海洋微藻保存方法的研究进展

张文慧，高金伟，姜智飞，范耘硕，周文礼通信作者

（天津农学院 水产学院，天津市水产生态与养殖重点实验室，天津 300384）

本文综述了海洋微藻保存常用方法，主要有继代保存法、低温冷冻保存技术、超低温保存技术、斜面保存法及脱水包埋法。继代保存法操作简单，保存时间短；斜面保存易携带，但琼脂收缩后藻细胞容易变形；低温冷冻保存操作简便，相对保存时间较短；超低温保存法适合藻类的长期保存；包埋脱水保存技术操作简单，不需要复杂的设备，不使用抗冻保护剂，但是，目前仍需要解决预培养条件、脱水速率、胶球含水量等关键技术问题。此外，本文概述了当前海洋微藻保存研究的进展及其保存的意义，为藻种的保存研究提供一定的基础。

保存技术；研究进展；保存意义

海洋微藻中所含的营养物质十分丰富，除了含有丰富的蛋白质、氨基酸、色素等，还富含EPA和DHA[1]。在育苗方面，海洋微藻是鱼、虾、贝等经济动物良好的饵料，且具有良好的分散性和保型性[2]，这是人工饵料所不具备的。除此之外，有些微藻还可以作为优良的饲料添加剂和环境改良剂[3]。但是，在微藻的培育过程中，由于藻类的生长周期较短，容易被其他藻种、细菌等污染。因此，在保存过程中，减少接种次数，防止微藻被染，找到一种既能长期保存藻种，又能维持藻种活性的方法十分必要。目前，我国微藻保存技术比较薄弱，现有的微藻种类有限，没有适当的保存方法而弃置藻种，使微藻资源浪费，在不同程度上限制微藻生物技术的发展[4]。近几年，我国在海洋微藻藻种的保存方面取得了一定的进展[5-8]。本文综述了藻种保存的几种方法及展望，旨在为科研工作者提供参考。

1 藻种保存研究进展及其意义

海洋微藻的培养周期比较短，在培育海洋微藻过程中，容易被其他藻种、细菌所污染。实验室培养，由于藻类繁殖迅速，需要频繁接种，导致剩余藻种浪费，因此，急需找到合适的方法长期保存微藻。尽管国内外很早开始研究海洋微藻，但是，海洋微藻的保存工作从20世纪初期才开始，目前，国际著名的海洋微藻保存机构有CCAP、SAG、UTEX、COBRA，已保存海洋微藻2 000多种[9]。但是，每种藻类都有其各自特殊的生态条件，保存藻类的方法也各有不同，需要在具体的研究、工作中更详细的探究。

2 藻种保存常用技术

2.1 继代保存法

继代保存法是目前采用的最普遍的藻种保存方法，是在常温或低常温条件下保存，常温指15～25 ℃，常低温指0～15 ℃，光照为6 μmol/（m2· s）。将海洋微藻接种在液体培养基中，先在适宜的温度、光强下培养，待微藻生长到一定密度后，将其转移到低温、弱光条件下保存。继代保存法操作简单，但是保存时间短，继代频繁，藻种容易被污染。

2.2 低温冷冻与超低温保存

在4 ℃的低温条件下，微藻细胞的细胞活力和生化活力均会下降，在此条件下保存微藻，可保存半年左右，可减少藻种的接种次数。一般情况下，将藻液移至离心管内，封口膜封好，置于4～5 ℃冰箱中保存。保存前，还可以将藻液离心，得到高密度的藻浓缩液后保存。利用低温冷冻方式保存的藻种，在更新接种时，需要15～20 d方才能正常生长。研究表明，4 ℃保存小球藻不宜超过6周[10]；三角褐指藻保存的最佳温度为0～10 ℃[11]；有低温保存前后藻中高度不饱和脂肪酸（HUFA）的含量变化不明显[12]；三角褐指藻在-20 ℃下保存20 d后，重新培养2 d即能恢复正常生长、繁殖[13]；海链藻在4、-4及-20 ℃保存时，蛋白质和糖的含量均会下降，且下降幅度随时间的延长而逐渐增加，脂肪含量下降不明显[14]。冷冻保存可保存细胞活力，在一定程度上抑制生物细胞的生化活性，能有效解决藻种保存过程中污染、混杂及变异，实现长期保存。

超低温保存，又称冰冻保存，通常用液态氮作为冷媒[15]。在此温度下，藻类的物质代谢和生长活动几乎完全停止，但仍处于可逆的成活状态。超低温保存最开始使用一步法，即在浓缩的藻液中加入甘油或DMSO（二甲基亚砜）后，直接投入液氮中保存。此方法只适用于少数微藻的保存，对含水量较高的藻类不适用。

之后，在一步法的基础上，研究出两步法的保存方法，先对保存的藻种进行预处理，加入抗冻保护剂，一般用二甲基亚砜（DMSO）、甘油和甲醇，浓度5％～15％。处理后的藻液放到冻存管里，按照0.5～4 ℃/min的降温速度，在-30～-60 ℃的温度下欲冻0～60 min后，迅速转移到液氮中保存。

超低温保存可以长期保持生物遗传稳定性，不仅可以对藻种进行优胜劣汰的选择，还能最大限度地减少藻种的污染，是当前长期保存藻种最为有效的方法。有研究表明[16]，超低温冷冻保存可以使7属9种微藻的22个品系的微藻存活5～8年。但是，目前藻类种类繁多，生理状态不同，因此，每种微藻保存的方法不一样，加入的抗冻剂的种类和浓度也不尽相同[17]。超低温保存研究目前只取得了初步的成果，许多问题尚需解决，例如，超低温保存条件没有一套标准的方法，一般建立在经验之上，增加实验风险，浪费人力物力，增加保存成本等，需要更多进一步的研究。

2.3 斜面保存

在微藻的培养液中加入0.7％～1％的琼脂，制成琼脂斜面固体培养基，制作固体培养基时，其营养物质的浓度应该在正常配方的基础上增加一倍。用平板划线的方法将藻种接种在固体培养基上，接种后的藻种，先置于适宜的环境下培养，待藻细胞达到一定密度后，在固体培养基上会形成藻种群落，肉眼可看到明显的条状或块状的藻细胞群，而后，将固体培养基移至低温、弱光条件下或置于冰箱中保存。一般情况下，斜面保存可保存1年左右，如果每天让藻种接受短时间弱光照射，可保存2～3年。

斜面保存方法操作简便，体积小，便于携带，是目前比较常用的保存方法，但琼脂斜面放置时间过长后，容易干燥收缩，造成藻细胞变形，因此，在重新接种的时候需要较长的时间。

2.4 包埋脱水保存

包埋保存主要是对微藻进行蔗糖预培养，运用细胞固定化方法的原理，将海洋微藻包埋在褐藻胶基质中，使其固定化，之后适度脱水，进行超低温保存[18]。

包埋脱水法将海洋微藻包埋在褐藻酸钙中，然后，置于高浓度的蔗糖培养基中进行预培养，继而用无菌空气流或硅胶进行脱水，最后置于液氮中保存。胶囊化可以较大限度的保护海洋微藻细胞的结构，使之不会因试验过程中温度的急剧变化而遭受破坏。脱水是将胶囊化材料的含水量降到一定程度，之后再投入液氮中保存，脱水方法有多种，常用的有直接干燥脱水、高浓度蔗糖预处理、硅胶吸附脱水等方法。

使用蔗糖处理是为了提高细胞质的浓度，增加其抗冻力和脱水力，以促进降温过程中玻璃化的形成。在蔗糖的使用过程中，既可以先将藻类包埋再进行高浓度的蔗糖培养，也可以先用高浓度的蔗糖培养再进行包埋，大部分研究会使用前者。使用蔗糖培养的时间与海洋微藻的种类、蔗糖的浓度有关，基本上遵循既使样品获得高的抗冻力和脱水力、又不能引起微藻细胞太多的高渗损伤的原则。包埋脱水保存法减少了低温冷藏过程中冰晶的产生量，快速升温融解时阻止了冰晶的再生，从而减少对微藻细胞的伤害。

包埋脱水法在低温冷藏过程中可减少冰晶的产生，在快速升温溶解过程中可阻止冰晶再生[19]，使海洋微藻细胞获得了较高的抗冻力，提高了保存效果，降低遗传变异的可能性。此技术操作简单，无需复杂的设备，不使用抗冻保护剂。但目前仍需要解决预培养条件、脱水速率、胶球含水量等关键技术问题。

3 展望

单细胞藻类保存在实际研究与生产中具有重要的实际意义，但是，保存技术尚未成熟与稳定。目前，对微藻的研究集中在生理生态水平和分子水平，基础的研究有待加强，许多问题有待进一步研究，例如，藻种是否可以保存更长的时间；大多数微藻保存均需要抗冻保护剂，传统的抗冻保护剂有一定的毒性，目前新的抗冻保护剂有抗冻蛋白（AFP）和冰结合蛋白（IBF），抗冻蛋白的性质与冰晶结构相似，可降低冰晶的生长速度，冰结合蛋白可抑制再结晶，从而起到保护细胞膜的作用[20]，但抗冻剂的用量仍需进一步的研究。

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The Preservation Technology of Marine Microalgae

ZHANG Wen-hui, GAO Jin-wei, JIANG Zhi-fei, FAN Yun-shuo, ZHOU Wen-liCorrespondingAuthor
（Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The paper summarizes several methods to preserve the marine microalgae, including succeeding preservation, cryopreservation technology at low temperature, the cryopreservation technique, save method and the embedding method of dehydration. Succeeding preservation is simple to operate, but the time is not long; agar slant is convenient to carry, but the aglae cells is out of shape easily after the agar shrink; cryopreservation technology at low temperature is also simple but the time is not long; the cryopreservation technique is suit to preservation for a long time; the embedding method of dehydration do not need the Complicated equipment and Cryoprotectant, but we should solve the key technical problems of culture conditions, dehydration rate and rubber ball water content. And provides an overview of the progress and significance of the research.

the preservation technology; the progress of the research; the significance

S931.1

A

1008-5394（2016）04-0055-03

2015-12-22

国家星火计划项目“海水鱼工厂化健康养殖关键技术示范与推广”（2013GA610002）；农业部水产品加工重点实验室开放基金“蛋白核小球藻CGF对环境因子胁迫响应及分子机理研究”（NYJG201508）

张文慧（1991-），女，河北保定人，硕士在读，主要从事渔业资源保护与环境修复研究。E-mail：773765349@qq.com。

周文礼（1969-），男，山东济宁人，研究员，博士，主要从事水域生态学和微藻资源化利用研究。E-mail：saz0908@126.com。